Pagyamanan iti panagbisita iti Nature.com.Ti bersion ti browser nga us-usarenmo ket addaan iti limitado a suporta para iti CSS.Para iti kasayaatan a padas, irekomendarmi nga agusarka iti na-update a browser (wenno iddepen ti compatibility mode iti Internet Explorer).Kabayatanna, tapno masigurado ti agtultuloy a suporta, ipakitami ti site nga awan dagiti estilo ken JavaScript.
Saan a kas kadagiti bertebrata, dagiti insekto ket nasaknap a naipagarup nga awanan kadagiti lalaki-a-naidasig a sex steroid a hormone.Iti Anopheles gambiae, ti ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) ket agparang a nagbalbaliw tapno makontrol ti panagrang-ay ti itlog no sintesis babaen dagiti kabaian2 ken tapno mangtignay ti panagasawa a refractory a panawen no seksual a mayakar babaen dagiti kalakian3.Manipud idi panagdakkel ti itlog ken panagasawa ket nasken a kababalin ti panagpaadu, ti pannakaawat no kasano a dagiti kabaian a lamok ti Anopheles ket mangitipon kadagitoy a hormonal a senial ket mabalin a mangpalaka iti disenio dagiti baro a programa a mangkontrol iti malaria.Ditoy, ipalgakmi a dagitoy nga aramid ti panagpaadu ket makontrol babaen dagiti naiduma a sex steroid babaen ti komplikado a network dagiti ecdysteroid-activating/inactivating enzymes.Nailasinmi ti maysa a kalakian-espesipiko nga oxidized ecdysone, . 3-dehydro-20E (3D20E), a mangsalaknib iti nagannak babaen ti panangiserrana iti seksual a panagawat ti babai kalpasan ti seksual a pannakayakar ken pannakapaaktibo babaen ti dephosphorylation.Ti nakadkadlaw, ti pannakayakar ti 3D20E ket nangiduron met iti pannakaiyebkas dagiti reproductive genes a mangtaginayon iti panagdakkel ti itlog bayat ti impeksion ti Plasmodium, a mangipasigurado iti salun-at dagiti naimpektaran a kabaian.Ti 20E a nagtaud iti babai ket saan a mangpataud iti seksual sungbat, ngem palubosanna dagiti agasawa nga indibidual nga agitlog kalpasan a malapdan dagiti 20E-inhibiting kinases.Ti pannakailasin daytoy a kalakian-espesipiko nga insekto nga steroid hormone ken ti akemna iti panangregulate iti seksual a panagawat ti kabaian, kinabunga ken pannakilangen iti Plasmodium ket mangisingasing iti potensial a mangkissay iti balligi ti panagpaadu dagiti lamok a mangyakar iti malaria.
Umad-adu manen dagiti kaso ken ipapatay ti malaria4 gapu iti nasaknap a resistensia iti insektisidio kadagiti lamok nga Anopheles, ti kakaisuna a mangyakar kadagiti parasito ti malaria ti tao.Ti biolohia ti panagasawa dagitoy a lamok ket partikular a makaawis a puntiria para kadagiti nobela a panangibabaet iti panangkontrol iti malaria gapu ta maminsan laeng nga agasawa dagiti kabaian5; ti panangaramid iti daytoy a maymaysa a pasamak ti panagasawa nga esterilisado ket addaan iti dakkel a potensial a mangkissay iti populasion dagiti lamok iti talon.
Agbalin a seksual a di makabael dagiti babbai kalpasan ti panangawatda kadagiti high-titer steroid hormones manipud kadagiti lallaki.Impakita dagiti panagadal a ti mangtignay iti rigat iti ad-adu pay a panagasawa ket ti 20-hydroxyecdysone (20E), maysa nga steroid hormone nga ad-adda a pagaammo kas regulator ti molting cycle iti larval stage.Ti abilidad dagiti kalakian a mangsintesis ken mangyakar iti 20E ket espesipiko a nagbalbaliw iti Dagiti sebbangan ti Anopheles a paset ti subhenero a Cellia7, a naiwarwaras idiay Aprika ken mairaman dagiti kapeggadan a mangyeg ti malaria, a mairaman ti Anopheles gambiae.Daytoy ket nangruna a naipangpangruna gapu ta kadagitoy a sebbangan dagiti kabaian ket mangpataud pay ti 20E kalpasan ti tunggal maysa a pannangan ti dara, ken ti 20E ket mangiturong ti siklo ti oogenesis (kitaen ti ref. 8).Nupay kasta, bassit ti ammo maipapan ti wagas a panagtipon dagiti kabaian signals manipud iti dua a nagduduma a gubuayan ti ecdysone (male transfer ken blood feeding induction) a dida maikompromiso ti bukodda nga abilidad nga agasawa.Kinapudnona, no ti 20E a patauden dagiti kabaian ket mangtignay iti seksual a di panaganus, daytoy ket mangiturong iti kinaawan ti anak kadagiti indibidual a mangtaraon iti birhen, gagangay unay a kababalin kadagitoy a lamok5.
Ti maysa a mabalin a panangipalawag ket dagiti kalakian ti A. gambiae ket mangiyalis ti nabaliwan a kalakian-espesipiko nga ecdysone, a mangpaaktibo ti maysa a signaling cascade iti babai a reproductive tract, a mangibunga iti panagasawa a kinaawan ti kinatalged.Nupay kasta, nupay dagiti bertebrata ket addaan kadagiti adu nga steroid a hormone, a kas ti estrogen ken androgen (narepaso iti ref. 9), iti pannakaammomi, dagiti androgenic-biased nga steroid ket saan pay a nailasin idi dagiti insekto.
Inkeddengmi a mangikeddeng ti repertorio dagiti steroid a hormone iti lalaki a lalaki nga aksesoria a glandula (MAG) ti seksual a nataengan nga A. gambiae nga agsapsapul kadagiti posible a mangbalbaliw nga steroid.Babaen ti panangusar iti nangato a panagaramid a likido a kromatograpia a naitipon iti tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) imbes a ti saan unay nga espesipiko a pamay-an a dati a nausar, naduktalanmi ti ecdysone (E) ken 20E iti daytoy a tisyu, a mangpasingked iti napalabas resulta.Nupay kasta, ti sample ket dominado babaen dagiti oxidized phosphorylated steroids, a maitunos iti pormula a 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Pigura 1).Dagiti dadduma a porma ket mairaman ti 3-dehydro-20E (3D20E) ken 20E-22-phosphate (20E22P).Ti HPLC-MS/MS signality ti Ti 3D20E22P ket dua nga order ti magnitude a nangatngato ngem ti dephosphorylated a pormana, 3D20E, ken tallo nga order ti magnitude a nangatngato ngem ti E ken 20E (Pigura 1).Nupay iti dadduma a paset ti bagi ken ti nababbaba a reproductive tract (LRT; Extended Data Fig. 1a).Inanalisarmi pay dagiti ecdys kadagiti baro a naserraan (<1 nga aldaw ti tawenna) a lallaki ken kabaian ken naduktalan ti 3D20E ken 3D20E22P laeng iti MAG; Ti E, 20E ken 20E22P ket adda idi iti agpada a sekso (Extended Data Fig. 1b).Dagitoy a datos ket mangisingasing a dagiti nataengan a kalakian ti A. gambiae ket mangpataud kadagiti nangato a titer ti mangbalbaliw a hormone kadagiti MAG-da a saan a sintesis babaen dagiti kabaian.
Ti MAG ken babai nga LRT (agraman dagiti atria, seminal vesicles, ken parovarium) ket na-dissect manipud iti 4-aldaw (4-aldaw) a birhen a kalakian ken birhen ken naasawaan a kabaian (0.5, 3, ken 12 hpm).Ti ecdysone kadagitoy a tisyu ket naanalisar babaen ti HPLC-MS/MS (mean ± sem; unpaired t-test, dua-sided, NS, saan a napateg, *P < 0.01: 3 nga oras vs. 0.5 nga oras, P = 0.035; 3 nga oras vs. 0.5 nga oras, P = 0.25;12 nga oras vs. 3 nga oras, P = 0.0032;12 nga oras vs. 0.5 nga oras, P = 0.015).Dagiti datos ket manipud iti tallo a biolohikal a replika.Ti kangatuan a kalawa para iti tunggal maysa nga ecdysone ti interes ket nakuenta ken na-normalize babaen ti bilang dagiti lamok.Ti Ecdysone ket naibagbaga babaen ti kolor a kas ti sumaganad: E, berde; 20E, kahel nga; 20E22P, lila nga; 3D20E, asul nga; 3D20E22P, rosas.Ti inset ket mangpaadu ti timbangan iti y-axis tapno mangipakita kadagiti nababbaba a lebel ti ecdysone.
Tapno mausig no ti 3D20E22P ken 3D20E ket mayakar bayat ti panagasawa, inikkatmi dagiti kabaian nga LRT kadagiti nadumaduma a punto ti panawen kalpasan ti panagasawa.Nupay saan a nasarakan ti ecdysone kadagiti birhen, napaliiwmi ti dakkel a kaadu ti 3D20E22P iti LRT a dagus kalpasan ti panagasawa (0.5 h kalpasan ti panagasawa, hpm), a bumasbassit iti panaglabas ti panawen, bayat Dagiti lebel ti 3D20E ket ngimmato unay (Fig. 1).Babaen ti panagusar ti kemikal a nasintisisar a 3D20E a kas maysa a pagalagadan, inkeddengmi a dagiti lebel daytoy nga steroid a hormone kadagiti panagasawa nga LRT ket di kumurang a 100-a-mamin-adu a nangatngato ngem ti 20E (Napalawa a Datos a Tabla 1).Gapuna, ti 3D20E22P ket isu ti kangrunaan a lalaki nga ecdysone a mayakar iti babai nga LRT bayat ti panagasawa, ken ti deposporila a pormana, ti 3D20E, ket agbalin a nangato unay kalpasan ti panagasawa.Daytoy ket mangisingasing ti napateg nga akem para iti naud-udi nga ecdysone iti kabaian a biolohia kalpasan ti panagasawa.
Kalpasan ti panangpataud iti baro nga RNA sequencing (RNA-seq) dataset ( Fig. 2a), babaen ti panagusar iti custom-built bioinformatics pipeline, nagsapulkami iti ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ken ecdysone a mangikodigo iti 20E-nabaliwan a phosphatase gene.EPP) ket naiyebkas kadagiti reproductive tissues.Nailasinmi ti maysa a kandidato nga EPP gene ken dua potensial nga EcK genes (EcK1 ken EcK2), ngem dida nakasarak iti nasayaat a kandidato nga EO gene.Ti nakadkadlaw, dagiti indibidual nga EPP genes ket naiyebkas kadagiti nangato a lebel (98.9th percentile) kadagiti Gambian MAGs ngem saan kadagiti babai nga LRT (Fig. 2b), a maisupadi kadagiti namnamaenmi manipud idi napasamak ti dephosphorylation ti 3D20E22P iti daytoy a tisyu ti babai.Gapuna, patienmi nga ti lalaki nga EPP ket mabalin a mayakar bayat ti panagasawa.Kinapudnona, nagusarkami iti in vivo a natalinaay nga isotope a panagmarka tapno maskaraan ti babai a protina kalpasan ti panagasawa, maysa nga enzyme a nailasin babaen ti MS iti babai nga atrium (Fig. 2c ken Supplementary Table 1).Ti kaadda ti EPP iti MAG ken napagasawa (ngem saan a birhen) a kabaian nga LRT ket napasingkedan met babaen ti panagusar kadagiti espesipiko nga antibody ( Fig. 2d ).
a, Maysa a custom-built bioinformatics pipeline tapno agsapul kadagiti reproductive tissues ti tunggal sekso para kadagiti genes a mangikodigo kadagiti EcKs, EOs, ken EPPs.Dagiti numero iti abay dagiti pana ket mangipakita ti bilang dagiti lalaki ken babai a kandidato iti tunggal addang.Daytoy nga analisar ket nangilasin ti maysa nga EPP gene (EPP) ken maysa nga EcK gene (EcK1) a maiyebkas kadagiti kalakian, ken maysa nga EcK gene (EcK2) a maiyebkas iti agpada a sekso ngem saan nga apit ti kandidato nga EO gene.b, Heatmap a mangidilig iti kandidato a gene nga ebkas kadagiti birhen (V) ken panagasawa (M) Anopheles gambiae ken Anopheles albicans tissues.Spca, panagpertilisar; MAGs, accessory glands kadagiti lallaki; dadduma pay a paset ti bagi, a mairaman dagiti suso, payak, saka, nalukmeg a bagi, ken dagiti akin-uneg nga organo iti agpada a sekso, ken dagiti obario kadagiti kabaian.Ti EcK2 ket nangato a naiyebkas nga agpada iti MAG ken dagiti atria ti Gambia, idinto a ti EPP ket masarakan laeng iti MAG.c, Proteomic analysis of male ejaculate group translocation into female atria at 3, 12 ken 24 hpm, a mangipakpakita kadagiti 67 a kaaduan a protina.Dagiti kabaian ket napadakkel iti taraon a naglaon iti 15N tapno maimarka (ken maskara) amin a protina.Dagiti saan a naimarka a kalakian ket naikapet kadagiti naimarka a kabaian, ken dagiti kabaian nga LRT ket na-dissect iti 3, 12 ken 24 hpm para iti proteomic analysis (kitaen ti Supplementary Table 1 para iti kompleto a listaan ​​dagiti ejaculatory proteins).Inset, EPP, Eck1 ken Naduktalan ti EcK2 iti MAG dagiti birhen a kalakian babaen ti proteomic analysis kadagitoy a tisyu.d, naduktalan ti EPP babaen ti western blot iti MAG ken LRT dagiti naasawaan a kabaian, ngem saan kadagiti birhen a kabaian wenno kalakian wenno ti dadduma pay a paset ti bagi ti babai.Naggigiddan a nasukimaten dagiti membrana babaen ti anti-actin (loading control) ken anti-EPP antibodies.Amin a kalakian ket birhen.See Supplementary Figure 1 para iti datos ti gubuayan ti gel.Namindua a naaramid dagiti Western blot nga addaan iti kapada a resulta.
Ti ecdysteroid phosphophosphatase nga aktibidad ti EPP ket naberipika kalpasan ti panaginkubasion babaen ti HPLC-MS/MS nga addaan iti 3D20E22P a naisina manipud iti MAG (Extended Data Fig. 2a).Maysa pay, idi pinagulimekmi ti EPP babaen ti RNA-mediated interference (RNAi), naduktalanmi ti napigsa a pannakakissay ti aktibidad ti phosphatase kadagiti reproductive tissues dagitoy a kalakian (Fig. 3a), ken kabaian mated with EPP-silenced males showed significant A nababbaba a paset ti dephosphorylated 3D20E (Fig. 3b) iti laksid ti paset a gene silencing (Extended Data Fig. 2b,c).Iti kasumbangirna, saanmi a naduktalan dagiti dakkel a panagbalbaliw iti 20E22P/20E a ratio kadagiti isu met laeng a lamok, a mabalin a mangisingasing a ti enzyme ket espesipiko para iti 3D20E22P ( Fig. 3b ). 3b).
a, Bimmaba ti aktibidad ti phosphatase iti MAG a gapuanan ti EPP silencing babaen ti panagusar kadagiti doble-stranded nga EPP RNA (dsEPP) wenno doble-stranded a GFP RNA (dsGFP) a kontrol.Duapulo a MAG pools ti nausar iti tunggal maysa a replika (P = 0.0046, paired t-test, dua-a-sikigan), a naibagbaga babaen dagiti agsina a tulnek.b, Dagiti kabaian a naikapet kadagiti EPP-silenced a kalakian ket addaan iti a signipikante a nababbaba a paset ti dephosphorylated a 3D20E iti 3 hpm (P = 0.0043, saan a naiparis a t-panangsubok, dua-a-sikigan), idinto a dagiti lebel ti 20E ket saan a naapektaran ( P = 0.063, saan a naiparis). t-test, two-sided).Dagiti datos ket naiparang a kas mean ± sem manipud iti tallo a pool ti 13, 16 ken 19 a kabaian ti tunggal maysa.c, Dagiti kabaian a nakikadua kadagiti EPP-silenced a kalakian ket addaan iti signipikante a nangatngato a rate ti panagasawa manen (P = 0.0002, Fisher’s exact test, dua-sided).Dagiti kabaian ket immuna a napilitan a makiasawa tapno masigurado ti kasasaadda iti panagasawa; 2 nga aldaw kalpasanna, nakontakda kadagiti dadduma a kalakian nga agaw-awit iti transgenic a semilia tapno matingiting dagiti re-mating rates babaen ti quantitative PCR detection ti transgene.d, Dagiti kabaian a nataraonan iti dara a nakikadua kadagiti EPP-silenced a kalakian ket addaan iti dakkel a bimmaba ti kinabunga (P < 0.0001; Mann-Whitney test, dua-sikigan) ken bassit a bimmaba ti bilang ti itlog (P = 0.088, Mann-Whitney test, dua-sided) , bayat a saan a naapektaran ti spawning rate (P = 0.94, Fisher’s exact test, dua-sided).Iti amin a panel, ti n ket mangibagi ti bilang dagiti biolohikal nga agwaywayas a sample ti lamok.NS, saan a napateg.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001 nga.
Sumaganad, in-assessmi no ti ecdysone dephosphorylation ket napateg para iti panangtignay iti panagandur ti panagasawa kadagiti kabaian.Ti nakadkadlaw, dagiti kabaian a nakiasawa kadagiti kalakian a nabusbos iti EPP ket nagpareho manen iti nangatngato nga amang a kasansan (44.9%) ngem dagiti kontrol a kabaian (10.4%) no naipadamag kadagiti kanayonan (transgenic) a kalakian ( Fig. 3c ).Napaliiwmi pay ti dakkel a panagbaba ti kinabunga ( Fig. 3c ). 3d, kannigid) ken bassit a panagbaba ti bilang dagiti itlog nga inted dagitoy a kabaian (Fig. 3d, tengnga), bayat a ti porsiento dagiti itlog nga inted dagiti kabaian (sabali pay a sungbat a naala kadagiti kabaian babaen ti panagasawa )) ket saan a naapektaran (Fig. 3d, kannawan).Gapu iti napaliiw nga espesipiko ti EPP para iti 3D20E22P, dagitoy a resulta ket mangisingasing a ti panagpaaktibo ti Ti 3D20E babaen ti EPP a nayakar bayat ti panagasawa ket mabalin nga addaan iti napateg nga akem iti panangiddep ti panagawat ti kabaian iti ad-adu pay a panagasawa, ti kababalin a dati a naibagbaga iti seksual a panagiyakar ti 20E .Gapuna, daytoy a lalaki-espesipiko a hormone ket napigsa pay nga apektaranna ti kinabunga ti kabaian.
Sumaganad, inkomparami dagiti aktibidad ti 20E ken 3D20E kadagiti eksperimento ti ineksion kadagiti seksual a nataengan a birhen babaen ti panangusar iti kemikal a nasintisisar a 3D20E ( Fig. 4a–c ) ken komersial a magun-od a 20E.Napaliiwmi a ti 3D20E ket nangruna nga ad-adda nga epektibo ngem ti 20E iti panangiserra iti sensibilidad ti kabaian iti panagasawa iti agpada a konsentrasion ( Fig. 4d ). ti pisiolohiko a lebel ti 3D20E iti LRT (1,066 pg kalpasan ti pannakaineksion vs. 2,022 pg kalpasan ti panagasawa) ket nangiduron ti maysa a paset dagiti refractory a kabaian a 20-a-mamin-adu a nangatngato ngem ti pisiolohiko a lebel ti 20E (361 pg kalpasan ti pannakaineksion) 24 nga oras kalpasan ti pannakaineksion iti kangatuan a konsentrasion 18 pg kalpasan ti panagasawa; Extended Data Table 1).Daytoy a resulta ket maitunos iti kapanunotan a ti seksual a panagiyakar ti 20E ket saan a mangpataud kadagiti panagasawa a refractory a panawen, ken ad-adda pay a mangitudo iti 3D20E a kas maysa a kangrunaan a banag iti panangsigurado ti relasion ti nagannak-anak.Ti 3D20E ket signipikante met nga ad-adda nga aktibo ngem ti 20E kadagiti panagsukimat ti panagitlog kadagiti birhen a kabaian (Fig. 4e), a mangisingasing a ti normal a rate ti panagitlog ket dakami napaliiw kalpasan ti paset nga EPP silencing ket gapu iti kaadda ti nabati nga aktibidad ti 3D20E a pinataud pay laeng babaen dagiti Mating-induced female factors.
(a,b) Ti 3D20E a kemikal a nasintisisar manipud iti 20E (a) nga addaan iti nangato unay a panagbalbaliw/episiensiana (dagiti datos a naiparang a kas ti kaatiddogan ± sem manipud kadagiti tallo nga agwaywayas a reaksion ti sintesis) (b).c, Ti espektro ti masa (baba a kagudua) ket eksakto a maipada iti ecdysone a nasarakan iti naasawaan a kabaian nga LRT (ngato a kagudua).d, No idilig iti 20E (0.63 μg, P = 0.02; (0.63 μg, P = 0.0002; 0.21 μg, P = 0.54; Ti eksakto a panagsubok ni Fisher, 2-sided).e, ti 3D20E nga ineksion ket nangiduron ti signipikante a nangatngato a rate ti panagispaw kadagiti birhen a kabaian ngem dagiti 10% a kontrol ti ethanol (0.21 μg, P < 0.0001; 0.13 μg, P = 0.0003; eksakto a panagsubok ni Fisher, dua-a-sikigan), bayat a ti 20E no idilig kadagiti kontrol Laeng kadagiti nangatngato a dosis (0.21 μg, P = 0.022; 0.13 μg, P = 0.0823; eksakto a panagsubok ni Fisher, dua-a-sikigan).3D20E ket nangiduron kadagiti signipikante a nangatngato a rate ti panagispaw ngem ti 20E iti nangatngato a dosis (0.21 μg, P = 0.0019; 0.13 μg, P = 0.075; eksakto a panagsubok ni Fisher, dua-a-sikigan).Iti amin a panel, ti n ket mangibagi ti bilang dagiti biolohikal nga agwaywayas a sample ti lamok.NS, saan a napateg.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.Ti datos ket manipud iti tallo a replika.
Kadagiti napalabas a panagadal, naikeddengmi a ti seksual a panagiyakar dagiti steroid a hormone ket mangtignay ti panagiyebkas ti MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), maysa a babai a reproductive gene a mangsalaknib kadagiti kabaian ti A. gambiae manipud iti impeksion ti P. falciparum Gastos ti salun-at gapu ti 13, ti makapapatay a parasito ti malaria ti tao.Gapu iti kinapateg ti MISO iti reproductive fitness ti Anopheles iti dagiti lugar a malaria-endemic, inkeddengmi nga ikeddeng no ania a hormone a 3D20E wenno 20E ti mangtignay iti pannakaiyebkas daytoy a gene.Natakuatanmi a bayat nga espesipiko wenno ad-adda a napigsa ti panangineksion ti 20E a nangtignay iti sumagmamano a nuklear a hormone receptor (HR), kas iti HR3 ken HR4, ken dagiti gagangay a target ti downstream steroid, kas kadagiti yolkogenic genes a Vg14, 15, 16, ad-adu ti MISO napigsa a naiduron babaen ti 3D20E (Extended Data Fig. 3).Gapuna, ti seksual a panagiyakar daytoy nga androgenic steroid hormone ket agparang a mangtignay kadagiti mekanismo a mangsalaknib kadagiti kabaian manipud kadagiti gastos a maited babaen ti parasitiko nga impeksion.Maysa pay, ti 3D20E ket naidumaduma nga apektaranna ti agpada nga isoporma ti E a reseptor nga EcR, a mangiduron ti EcR-A ken mang-repress EcR-B, ken ad-adda a napigpigsa a mangtignay kadagiti dadduma pay a genes a mangtignay iti panagasawa, agraman ti HPX15, a mangapektar iti kinabunga ti kabaian.Daytoy ket mabalin a mangilawlawag iti napateg a kinaawan ti anak a napaliiw kadagiti kabaian a nakiasawa kadagiti kalakian a naulimek iti EPP (Napalawa a Datos Fig. 3).Dagitoy a datos ket mangisingasing ti kaadda dagiti dalan iti baba ti ayus a kaykayat a naaktibo babaen ti dua nga ecdysone a hormone a mabalin a nakaibatayan ti sex-specific function.
Sumaganad, sinubokmi ti panagandar dagiti dua nga EcK a gene a nailasin iti bioinformatics pipeline-mi.Ti panangpaulimek iti EcK1 wenno EcK2 ket nagresulta iti dakkel a mortalidad kadagiti lallaki (Extended Data Fig. 4a), a mangisingasing a ti ecdysone phosphorylation, ken ngarud ti inactivation, ket napateg para iti panagbiag.Gapu ta ti EcK2 ket naiyebkas kadagiti nangatngato a lebel ngem ti EcK1 ken naduktalan kadagiti MAGs babaen proteomics (Fig. 2b,c ken Supplementary Table 2), pinasingkedanmi ti aktibidadna nga ecdysteroid kinase babaen ti panangi-incubate iti daytoy iti 20E, a nagresulta iti phosphorylation 20E22P (Extended Data Figure 2).4b).Idi agus-usar iti 3D20E kas substrate, saanmi a naduktalan ti phosphorylated a produkto a 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), a mangisingasing a Ti 20E imbes a ti 3D20E ket mabalin a ti kaykayat a puntiria ti EcK2.
Segun iti RNA-seq analysis mi, ti EcK2 ket nangato met a naiyebkas iti LRT dagiti birhen a kabaian, a sadiay ket naiddep kalpasan ti panagasawa (Fig. 2b).Pinasingkedanmi dagitoy a datos ken inkeddengmi a ti EcK2 nga ebkas ket saan a naapektaran babaen ti panagpakan iti dara (Extended Data Fig. 5a).Iti panangpalawa kadagiti immuna nga eksperimentomi iti MS, naikeddengmi a ti pantok ti 20E22P ket asideg a nainaig iti pantok ti 20E (22-26 nga oras kalpasan ti pannangan iti dara; Napalawa a Datos Fig. 5b).Ti panangpaulimek iti EcK2 kadagiti birhen a kabaian ket nagresulta iti 3-a-mamin-adu a panagngato ti relatibo a ratio ti 20E agingga iti 20E22P iti 26 h kalpasan ti pannangan iti dara (Extended Data Figures 2c ken 5c), a mangpasingked a ti EcK2 ket mangposporila met iti 20E iti kabaian.Ti naipangpangruna, dagiti EcK2-depleted a birhen ket nagtalinaed ti naan-anay a seksual a panagawat (Extended Data Fig. 5d,e), nga ad-adda pay a mangisingasing a ti kabaian a panagpataud ti 20E ket saan a mangtignay kadagiti panagasawa a refractory a panawen.Nupay kasta, dagitoy a kabaian ket addaan iti dakkel a panagngato ti panagitlog a rate no idilig kadagiti kontrol, nga addaan iti nasurok a 30% kadagiti birhen nga agitlog (Extended Data Fig. 5f).No dagiti doble-stranded nga Eck2 RNA (dsEcK2) nga ineksion ket naaramid kalpasan ti panagpakan ti dara, saan a napasamak ti panagispaw, iti daytoy a punto ti 20E a pantok gapu iti panaginem ti dara ket bimmaba.Iti pakabuklan, dagitoy a resulta ket mangsuporta ti modelo a ti 20E a napataud kalpasan ti panagsusop ti dara ket mabalin a mangtignay ti panagispaw, ngem no laeng ti spawning block (EcK2 ken mabalin a dadduma pay a banag) ket nagturong off by mating.Uray dagiti 20E wenno 3D20E nga ineksion ket saan a nanglapped ti EcK2 a panagiyebkas kadagiti birhen (Napalawa a Datos Fig. 5g), a mangisingasing a dagiti dadduma a banag ket mangiballaet ti pananglapped iti daytoy a kinase.Nupay kasta, dagiti lebel ti 20E kalpasan ti panagpakan iti dara ket saan nga umdas a mangtignay ti pannakariribuk ti panagasawa, ngem epektibo a natignay babaen dagiti nangato a titer ti seksual a nayakar a 3D20E.
Dagiti resultami ket mangipaay kadagiti napateg a pannakaammo kadagiti mekanismo a mangregula ti balligi ti panagpaadu ti A. gambiae.Ti maysa a modelo ket rimsua a sadiay dagiti kalakian ket nagbalbaliw tapno mangsintesis kadagiti nangato a titer ti 3D20E, ti maysa a lalaki-espesipiko a nabaliwan nga ecdysone a mangipasigurado ti panagbalin a nagannak babaen ti panangikkat ti sensibilidad kadagiti kabaian iti ad-adu pay a panagasawa.Iti isu met laeng a panawen, dagitoy a mangiturong ti malaria ket nagbalbaliwda pay ti episiente a sistema tapno ag-synthesis 3D20E kadagiti kabaian a kas sungbat iti seksual a panagiyakar ti lalaki-espesipiko nga EPP.Iti pannakaammomi, daytoy ti umuna a pagarigan ti lalaki- ken babai-a-dominado nga steroid hormone system nga agar-aramid iti naisangsangayan ken kritikal nga aramid kadagiti insekto.Ti lalaki-espesipiko nga ecdysone function ket napostulado ngem saan a depinitibo a naipakita.Kas pagarigan, ti maysa a kaaduan a nasuppiat a hipotesis 18 ket dagitoy nga aramid ket mabalin nga aramiden babaen ti 20E precursor E1.Pagaammo unay nga idiay Drosophila, ti monandry ket matignay babaen ti seksual a panagiyakar dagiti babassit a sex peptides19,20 a makilanglangen kadagiti neuron a mang-innerva iti babai a reproductive tract babaen kadagiti espesipiko a sex peptide receptors21,22.Kasapulan ti kanayonan a trabaho tapno maikeddeng dagiti downstream signaling cascades a kontrolado ti 3D20E kadagiti kabaian nga A. gambiae ken tapno maikeddeng no dagitoy a kaskada ket mabalin a maitalimeng iti nagbaetan dagiti lamok ken ti Drosophila.
Gapu iti napateg nga akem ti 3D20E iti kinabunga ken kababalin ti babai a nailasin iti panagadalmi, dagiti dalan nga agturong iti 3D20E a sintesis ken panagpaaktibo ket mangitukon kadagiti baro a gundaway para kadagiti masakbayan nga estratehia ti panangkontrol iti lamok, kas iti pannakapataud dagiti makisalisal nga esterilisado a kalakian kadagiti estratehia ti teknolohia ti esterilisado nga insekto Usaren para iti atap a pannakairuar wenno tapno tuladen ti 3D20E iti birhen nga ay-ayam.Ti ti lalaki-espesipiko a panagandar ti 3D20E ket mabalin a nagbalbaliw idi ti A. gambiae ken dagiti dadduma pay a sebbangan ti Cellia ket nakagun-od ti abilidad a mang-coagulate ti semiliada kadagiti panagasawa a plug, gapu ta daytoy ket mangipalubos ti episiente a panagiyakar kadagiti adu a bilang dagiti hormone ken dagiti hormone-a-mangpaaktibo nga enzyme.Iti kasumbangirna, ti 3D20E nga ebolusion a mangipatungpal ti monandria ket mangipaay ti mekanismo para kadagiti kabaian (babaen ti nangato a panagiyebkas ti MISO) tapno pabor kadakuada reproductive fitness kadagiti lugar a nangato ti panagsaknap ti malaria, a saan a direkta a makatulong iti pannakayakar ti Plasmodium.Gapu ta naipakita a ti kabaian a 20E ket addaan iti nauneg nga epekto iti panagbiag ken panagdakkel ti P. falciparum kadagiti kabaian a lamok nga Anopheles,24 agpada a dagiti dalan ti lalaki ken babai nga steroid hormone ket kangrunaan itan nga aspeto ti panagtitinnulong ti lamok-parasito.
Dagiti kita ti A. gambiae G3 ket nataraken iti sidong dagiti gagangay a kasasaad ti insekto (26-28 °C, 65-80% a relatibo a dam-eg, 12:12 h nalawag/nasipnget a photoperiod).Dagiti larva ket nataraonan iti napulbos a taraon ti ikan (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ken Tetra Pond Sticks iti ratio a 7:7:2).Nataengan dagiti lamok ket nataraonan ad libitum iti 10% a dextrose solution ken linawas a dara ti tao (dagiti paset ti dara ti panagadal).Nagun-od dagiti birhen a lamok babaen ti panangilasin kadagiti sekso iti pupal stage kalpasan ti panangsukimat kadagiti murdong babaen ti mikroskopia.Dagiti kalakian nga awit ti DsRed transgene ket nailadawan iti napalabas.
Dagiti napilit nga eksperimento ti panagasawa ket naaramid segun kadagiti dati a nailadawan a protocol.Para iti natural a panagasawa, dagiti 4-aldaw a birhen a kabaian ket natengngel iti 1:3 a ratio kadagiti seksual a nataengan a birhen a kalakian iti dua a rabii.Para kadagiti eksperimento a dagiti kalakian ket nai-inject iti dsEPP, ti co-caging ket naigiddan kadagiti aldaw 3-4 kalpasan ti pannakaineksion, idi ti aktibidad ti phosphatase ket kaaduan a naulimek (Napaatiddog Datos Fig. 2b).
Dagiti tisyu ti lamok, nabati a bangkay (nabati a paset ti bagi), wenno sibubukel a bagi ket na-dissect iti 100% a methanol ken na-homogenize babaen ti beader (2 mm glass beads, 2,400 rpm, 90 sec).Dagiti kaadu ti tisyu ken dagiti tomo ti methanol ket kastoy: nabati a paset ti bagi, 50 iti 1,000 μl; MAG, 50-100 nga 80 μl; babai LRT, 25–50 80 μl.Ti precipitate ket naipasidong iti maikadua a methanol extraction nga addaan iti isu met laeng a tomo ti methanol.Ti rugit ti selula ket naikkat babaen ti centrifugation.Ti methanol manipud iti agpada a panagala ket napagtipon ken namaga iti sidong ti panagayus ti nitroheno, kalpasanna nasuspenso manen kadagiti sumaganad a tomo ti 80% a methanol iti danum: nabati a paset ti bagi, 50 μl nga; Dagiti MAG ken babai nga LRT, 30 μl.
Naanalisar dagiti sample iti mass spectrometer (ID-X, Thermo Fisher) a naikapet iti instrumento ti LC (Vanquish, Thermo Fisher).5 μl ti sample ket nai-inject iti 3 μm, 100 × 4.6 mm a kolum (Inspire C8, Dikma) a natengngel iti 25 °C.Dagiti mobile phases para iti LC ket A (danum, 0.1%). formic acid) ken B (acetonitrile, 0.1% formic acid).Ti LC gradient ket kastoy: 5% B iti 1 a minuto, kalpasanna ngimmato iti 100% B iti las-ud ti 11 a minuto.Kalpasan ti 8 a minuto iti 100%, i-equilibrate manen ti kolum iti 5% B iti 4 a minuto.Ti flow rate ket 0.3 ml min-1.Ionization iti MS source is maibanag babaen ti nabara nga electrospray ionization kadagiti positibo ken negatibo a wagas.
Ti mass spectrometer ket mangrukod ti datos iti m/z a sakop manipud iti 350 aginggana iti 680 iti 60,000 a resolusion iti naan-anay nga MS a kasasaad.Ti datos ti MS/MS ket nagun-od iti [M + H]+ (amin a puntiria), [M - H2O + H]+ (amin a puntiria), ken [M - H]- (dagiti naposporila a puntiria).Ti datos ti MS/MS ket naus-usar a mangpasingked kadagiti tagikua ti ecdysone dagiti puntiria a para iti daytoy ket awan ti pagalagadan was available.Tapno mailasin dagiti saan a naipuntiria nga ecdysteroids, naanalisar ti datos ti MS/MS para kadagiti amin a pantok ti HPLC nga addaan iti >15% a relatibo a kinaadu.Kuantipikar babaen ti panangusar kadagiti pagalagadan a kurba a naparsua manipud kadagiti puro a pagalagadan (20E, 3D20E) tapno makalkula dagiti absoluto a kaadu wenno pannakarunaw ti maysa nga espesipiko a sample (amin a dadduma a puntiria) tapno makalkula ti kapada dagitoy kadagiti kaadu a masarakan iti maysa a lalaki.Para 3D20E, ti panagkuantipika ket naaramid babaen ti panagusar ti kaaduan dagiti sumaganad nga adducts: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Dagiti datos ket naala ken nakuantipikar babaen ti panagusar ti Tracefinder (bersion 4.1).Naanalisar ti datos ti MS/MS babaen ti panagusar ti Xcalibur (bersion 4.4).Ti MS nga espektro ti E, 20E ken 3D20E ket naipadpada kadagiti agsasaruno a pagalagadan.Ti 3D20E22P ket naanalisar babaen ti derivatization babaen ti Girard's reagent.20E22P ket naanalisar babaen ti m/z a ratio.
Ti 3D20E22P ket nadalus manipud iti MAG.Ti panagdalus ket naaramid iti analitikal a sukog babaen ti panagusar ti ultra-performance liquid chromatograph (Acquity, Waters) nga addaan iti quadrupole mass-based detector (QDa, Acquity, Waters) iti sidong dagiti isu met laeng a kasasaad ti LC a kas ti HPLC-MS/MS analysis.Natignay ti panagkolekta ti fraksion idi ti m/z a katupag ti 3D20E22P naduktalan iti isu met laeng nga oras ti panagtalinaed a kas iti dati a naikeddeng.Ti kinadalus dagiti naala a kompuesto ket kalpasanna nasukimaten babaen ti HPLC-MS/MS kas nailadawan iti ngato.
Ti dagup nga RNA ket naala manipud iti 10-12 a reproductive tissues wenno dadduma pay a paset ti bagi (awan ulo) babaen ti panagusar ti TRI reagent (Thermo Fisher) babaen ti panangsurot kadagiti instruksion ti agpatpataud.Naagasan ti RNA babaen ti TURBO DNase (Thermo Fisher).Naaramid ti cDNA babaen ti Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) kalpasan ti instruksion ti agpatpataud.Dagiti primera para iti baliktad a transkripsion a kuantitatibo a PCR (RT-qPCR; Napalawa a Datos a Tabla 2) ket dati a naipablaak24 wenno nadisenio babaen ti panagusar ti Primer-BLAST26, nga addaan iti kaykayat a naited kadagiti produkto a 70-150 bp ti kadakkel ken mangsaklaw kadagiti exon-exon a panagsasabtan wenno dagiti Primer a paris a primera ket mangisina kadagiti exon.cDNA a sample manipud iti tallo aginggana iti uppat a biolohikal a replika ket nabartek iti uppat a daras iti danum para iti RT-qPCR.Ti panagkuantipika ket naaramid iti 15 μl a replikado a reaksion a naglaon iti 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), dagiti primers, ken 5 μl ti nabartek a cDNA.Dagiti reaksion ket napataray iti QuantStudio 6 Pro real-time PCR system (Thermo Fisher) ken dagiti datos ket naurnong ken naanalisar babaen ti panagusar ti Design ken Panag-analisar (bersion 2.4.3).Kas naipakita iti daytoy a panagadal, dagiti relatibo a kaadu ket na-normalize iti ribosomal gene RpL19 (AGAP004422), a ti panagiyebkasna ket saan a nagbalbaliw a dakkel iti panagpakan ti dara 27 wenno panagasawa 3 .
Ti kalidad ti RNA ket nasukimaten babaen ti panagusar ti Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent).Dagiti Illumina paired-end a biblioteka ket naisagana ken napataray idiay Broad Institute ti MIT ken Harvard.Dagiti panagsasaruno a panagbasa ket naitunos iti A. gambiae a genome (PEST a kita, bersion 4.12) babaen ti panagusar ti HISAT2 (bersion 2.0.5) nga addaan kadagiti default a parametro.Dagiti panagbasa nga addaan iti kalidad ti panagmapa (MAPQ) nga iskor <30 ket naikkat babaen ti panagusar ti Samtools (bersion 1.3.1).Ti bilang dagiti panagbasa a namapa kadagiti gene ket nabilang babaen ti panagusar ti htseq-count (bersion 0.9.1) nga addaan kadagiti default a parametro.Dagiti normal a bilang ti panagbasa ket nakuenta ken ti naidumaduma a panagiyebkas ti gene ket naanalisar babaen ti panagusar ti pakete ti DESeq2 (bersion 1.28.1) iti R (bersion 4.0.3).
Dagiti kandidato ti gene a mangbalbaliw ti ecdysone ket nailasin babaen ti umuna a panagbiruk ti genome ti A. gambiae babaen ti panagusar ti PSI-BLAST nga algoritmo (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), babaen ti panagusar kadagiti default a pateg Dagiti parametro nga addaan kadagiti sumaganad a panagsasaruno ti protina ti panagsaludsod: manipud iti Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Aksesion No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ken XP_011294434.1) ken Microplitis a demolitor (Aksesion No. XP_00852646.1 ken XP_008552645.1)) EcK manipud iti B. mori (Aksesion No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Aksesion No. NP_651202), Apis mellifera (Aksesion No. XP_394838) ken Acyrthosiphon pisum (Aksesion No. XP_001947166); ken EPP manipud iti B. mori (Aksesion No. XP_001947166) NP_001177919.1 ken NP_001243996.1) ken EO ti D. melanogaster (Aksesion No. NP_572986.1) (addang 1).Sumaruno, dagiti panagdungpar ti pagsala a naibatay iti nangato nga ebkas ti mRNA (>100 dagiti pirgis/kilobase nga ekson iti tunggal maysa a milion a namapa a panagbasa (FPKM) wenno >85%) iti tisyu ti panagpaadu (babai nga LRT wenno MAG) idiay Gambia (addang 2 ). Tapno mapasayaat ti kinaespesipiko, napilimi dagiti kandidato nga enzyme a maiyebkas met iti reproductive tissue ti A. albimanus, maysa nga anopheles species a saan a mangsintesis wenno mangyakar iti ecdysone bayat ti panagasawa.Dagiti kandidato a gene ket nasala a naibatay iti nababa nga ebkas (<100 FPKM wenno <85th percentile) iti A. albimanus reproductive tissue (addang 3).As a final filter (addang 4), dagiti kandidato a gene ket kasapulan a mangpennek ti uray maysa kadagiti sumaganad: (1) signipikante nga up-regulated kalpasan ti panagasawa (P < 0.05) segun ti panaganalisar kadagiti naidumaduma a naiyebkas a gene ken (2) kadagiti saan a panagpaadu a tisyu (< 85 % wenno <100 FPKM).
Binaliwanmi dagiti dati a nailadawan a pamay-an 28,29,30 tapno magun-od ti sibubukel-organismo nga isotopiko a panagmarka.Iti apagbiit, ti atap a tipo a Saccharomyces cerevisiae a tipo II (YSC2, Sigma) ket nasubok iti lebadura a nitroheno a batayan (BD Difco, DF0335) a naglaon iti (wt/vol) 2% a glukosa (G7528, Sigma), 1.7%. awanan iti amino acid ken ammonium sulfate. culture medium) ken 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) kas kakaisuna a gubuayan ti nitroheno.Naala ti lebadura babaen ti centrifugation ken dagiti larva ti lamok ket nataraon ad libitum agingga iti pupation.Supplement iti fishmeal (0.5 mg iti kada 300 nga larva) tapno malapdan ti maikapat nga instar mortality.Dagiti laeng kabaian ti nausar kalpasanna kadagiti eksperimento ti panagasawa kadagiti saan a naimarka a kalakian tapno analisaen ti kalakian a proteome a nayakar bayat ti panagasawa.
Dagiti 4-6 nga aldaw nga 15N-tagged a birhen a kabaian ket napilitan a makiasawa kadagiti age-matched untagged a birhen a kalakian.Ti naballigi a panagasawa ket naberipika babaen ti panangduktal kadagiti mating plugs iti sidong ti epifluorescence microscopy.Iti 3, 12, ken 24 hpm, dagiti atria ti 45-55 a nai-tag a kabaian ket na-dissect iti 50 μl nga ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) ken homogenized babaen ti pestle.Ti homogenate ket nasentripugo ken ti supernatant ket nalaokan iti 50 μl ti 0.1% RapiGest (186001860, Waters) iti 50 mM ammonium bicarbonate.Ti supernatant ken pellet manipud iti tunggal sample ket snap frozen iti namaga a yelo ken naipatulod iti maysa a rabii iti MacCoss laboratory idiay University of Washington, a sadiay ti panagsagana ti sample para iti LC-MS/MS ket nalpasen.Isuspende manen ti pellet iti 50 μl ti 0.1% RapiGest iti 50 mM ammonium bicarbonate ken sonicate iti water bath.Ti konsentrasion ti protina ti pellet ken supernatant ket narukod babaen ti BCA assay, dagiti sample ket naikkat babaen ti 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated babaen ti 15 mM iodoacetamide (Sigma) ken naipatakder iti 37 °C (1:0 50) iti 1 nga oras nga addaan iti trypsinization: trypsin:substrate ratio).Ti RapiGest ket na-lyse babaen ti pannakainayon ti 200 mM HCl, a sinaruno babaen ti panaginkubasion iti 37 °C iti 45 a minuto ken sentripugo iti 14,000 rpm iti 10 a minuto iti 4 °C tapno maikkat dagiti rugit.Dagiti sample ket nabugguan babaen ti dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) ken nasuspende manen iti 0.1% a pormiko nga asido para iti maudi a konsentrasion ti protina iti 0.33 μg μl-1.Dagiti saan a naimarka a proteoma ti MAG ket kapada a naanalisar manipud iti birhen males.Dua nga analytical replicates ti naanalisar para iti tunggal sample.Sumaruno, 1 μg ti tunggal maysa ket naanalisar babaen ti panagusar ti 25-cm fused silica 75-μm column nga addaan iti 4-cm fused silica Kasil1 (PQ) frit trap a napno iti Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) ken 180-minuto a likido a kromatograpia. Dagiti sample digests – Ti MS/MS ket napataray iti Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) nga addaan iti nanoACQUITY UPLC System (Waters).Dagiti mainaig iti datos a datos ti panaggun-od a napataud para iti tunggal panagtaray ket nabaliwan iti pormat ti mzML babaen ti panagusar ti Proteowizard (bersion 3.0.20287) ken babaen ti panagusar ti Comet31 (bersion 3.2) a maibusor iti database ti FASTA a naglaon ti protina dagiti panagsasaruno manipud iti Anopheles gambiae (VectorBase bersion 54), Anopheles coluzzi Ti panagbiruk ket naaramid iti Mali-NIH (VectorBase bersion 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Marso 2021), A. gambiae RNA-seq, ken dagiti tallo-a-kuadro a panagipatarus dagiti ammo a kontaminado ti tao.Dagiti peptido a mapa-mapada nga FDR ket naikeddeng babaen ti panagusar Percolator32 (bersion 3.05) nga addaan iti threshold a 0.01, ken dagiti peptido ket naurnong kadagiti pannakailasin ti protina babaen ti panagusar ti protina a parsimonia iti Limelight33 (bersion 2.2.0).Ti relatibo a kinaadu ti protina ket nakarkulo babaen ti panagusar ti normalisado nga espektral a kinaadu a banag (NSAF) a nakuenta para iti tunggal maysa a protina iti tunggal maysa a panagtaray a kas ti dati a nailadawan.Ti NSAF a relatibo iti tunggal maysa a protina ket napromedio iti ballasiw dagiti sample manipud iti dua a nadumaduma a biolohiko replicates.15N labeling ket sibaballigi a nangmaskara iti babai a proteome, nupay ti bassit a kaadu ti saan a naimarka a protina ket mabalin a maduktalan manipud kadagiti naimarka a birhen.Nairekordmi ti pannakaduktal ti lalaki a panagkissay ti protina (1-5 nga espektro) kadagiti kabaian a hilaw a sample kadagiti teknikal laeng a panagtaray, a sadiay dagiti hilaw a sample ket napataray kalpasan dagiti lalaki/mating a sample, kas resulta ti HPLC “carry over”.Sagpaminsan a protina a nasarakan a kas dagiti ‘kontaminado’ manipud kadagiti naimarka a birhen ket nailista iti Supplementary Table 1.
Dua nga antigenic peptides, QTTDRVAPAPDQQQQ (iti uneg ti isotype PA) ken MESDGTTPSGDSEQ (iti uneg ti isotype PA ken PB) iti Genscript.Ti dua a peptides ket napagtipon, kalpasanna naikonjugado iti carrier protein KLH ken nai-inject kadagiti koneho ti New Zealand.Dagiti koneho ket naidaton kalpasan ti maikapat nga injection, ken ti dagup nga IgG ket naisina babaen ti affinity purification.Ti IgG manipud iti kaaduan nga EPP-espesipiko a koneho ket naus-usar para iti ad-adu pay a western blotting.
Para kadagiti western blot, ti MAG (n = 10, a sadiay ti n ket mangibagi ti bilang dagiti biolohikal nga agwaywayas a sample ti lamok) ken kabaian nga LRT (n = 30) manipud kadagiti 4-aldaw nga agtawen a birhen a kalakian ken birhen wenno puersa-a-naikasar a kabaian (<10 kalpasan ti panagasawa), Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25%). sodium deoxycholate;150 mM NaCl;1 mM EDTA; °C.Dagiti protina ket nakuantipikar babaen ti Bradford assay (Bio-Rad).Kalpasanna, 20 μg ti MAG a protina, 40 μg ti LRT a protina, ken 20 μg ti nabati a bulk a protina ket na-denature ken naisina babaen ti 10% Bis-Tris NuPAGE babaen ti panagusar ti MOPS buffer.Dagiti protina ket nayakar kadagiti polyvinylidene fluoride membranes babaen ti panagusar ti iBlot2 transfer sistema (Thermo Fisher).Dagiti membrana ket nabugguan iti mamindua iti 1× PBS-T (0.1% Tween-20 iti PBS) ken kalpasanna nabara iti Odyssey blocking buffer (Li-Cor) iti 1 nga oras iti 22°C.Dagiti membrana ket napagkintayeg iti maysa a rabii iti 4 °C babaen ti custom rabbit anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 iti blocking buffer) ken koneho anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000).Dagiti membrana ket nabugguan babaen ti PBS-T ken kalpasanna ket naipatakder babaen dagiti segundario nga antibody (asno nga anti-koneho 800CW ken kalding nga anti-rat 680LT (Li-Cor), agpada a 1:20,000) iti blocking buffer nga addaan iti 0.01% SDS ken 0.2%. Tween -20 iti 1 nga oras iti 22 °C.Dagiti membrana ket nabugguan babaen ti PBS-T ken nailadawan babaen ti Odyssey CLx scanner.Dagiti ladawan ket naurnong ken naproseso iti Image Studio (bersion 5.2).Ti espesipiko a banda a katupag ti EPP-RA isoform (82 kDa) ket saan a naduktalan.
Dagiti rehion ti panagkodigo ti EPP (kas ti isoporma nga AGAP002463-RB a naglaon ti histidine phosphatase a dominio, NCBI a napreserba a dominio a panagbiruk 34) ken EcK2 (AGAP002181) ket naiklon iti pET-21a(+) a plasmid (Novagen Millipore Sigma) ; dagiti primers ket nailista iti Extended Data Table 2.Walo a GS4 linkers (in tandem) ket naikabil sakbay ti C-terminal 6xHis tag ti pET-21a(+)-EcK2 construct.Dagiti rekombinante a protina ket napataud babaen ti panagusar ti NEBExpress cell-free E. coli protein synthesis reaction (New England BioLabs).Dagiti rekombinante a protina ket nadalus babaen ti panagusar kadagiti NEBExpress Ni spin columns (New England BioLabs).Ti dihydrofolate reductase (DHFR) a kontrol a protina ket napataud babaen ti panagusar ti plantilia ti DNA manipud iti NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit.Dagiti protina ket naidulin iti 50% a glycerol iti PBS iti -20 °C aginggana iti 3 a bulan.
Narukod ti aktibidad ti phosphatase ti EPP ken tissue extracts babaen ti 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich).Ti reaksion a buffer ket naglaon iti 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ken 1 mM DTT.Ti tissue ket homogenized iti reaksion a buffer ken dagiti rugit ti selula ket naikkat babaen ti centrifugation.Irugi ti reaksion babaen ti pananginayon ti enzyme wenno tissue extract iti reaction buffer nga addaan iti 2.5 mg ml-1 pNPP.Ti reaksion a naglaok ket naipatakder iti temperatura ti kuarto iti nasipnget, ken ti kaadu ti pNP a nakomberte manipud iti pNPP ket nakuantipikar babaen ti panangrukod ti absorbance iti 405 nm iti nadumaduma a panawen.
Para iti in vitro nga aktibidad ti EcK, ti protina ket naipatakder iti 0.2 mg 20E wenno 3D20E iti 200 μl a buffer (pH 7.5) a naglaon iti 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ken 10 mM MgCl2 iti 2 h iti 27 °C .Ti reaksion ket naisardeng babaen ti pananginayon iti 800 μl methanol, kalpasanna nalamiis iti -20 °C iti 1 nga oras, kalpasanna nasentripugo iti 20,000 g iti 10 a minuto iti 4 °C.Ti supernatant ket kalpasanna naanalisar babaen ti HPLC-MS/MS.Tapno heat-inactivate dagiti protina a nausar iti kontrol a grupo, dagiti protina ket naipatakder iti 50% glycerol iti PBS iti 20 min iti 95°C.
Para iti in vitro nga aktibidad ti EPP, ti protina ket naipatakder iti 3D20E22P (katupag ti kaadu a nasarakan iti 18 a paris ti MAG, nadalus babaen ti HPLC-MS/MS) iti 100 μl a buffer (pH 7.5) a naglaon iti 25 mM Tris, 50 mM nga asido nga asetiko, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, . 0.1 mM EDTA, ken 1 mM DTT iti 3 nga oras iti 27 °C.Ti reaksion ket naisardeng babaen ti pananginayon iti 400 μl a metanol ken nalamiis iti -20 °C iti 1 nga oras, kalpasanna nasentripugo iti 20,000 g iti 10 a minuto iti 4 °C.Ti supernatant ket naanalisar babaen ti HPLC-MS/MS.
Dagiti pirgis ti PCR para iti EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ken EcK2 (556 bp) ket naamplifikar manipud iti cDNA a naisagana manipud kadagiti naglaok-sekso nga awan ulona a lamok a bangkay.Ti pirgis ti PCR ti kontrol ti eGFP (495 bp) ket naamplifikar manipud iti dati a nailadawan a pCR2.1-eGFP; Dagiti PCR primers ket nailista iti Extended Data Table 2.Ti PCR fragment ket naikabil iti nagbaetan dagiti nabaliktad a T7 promoters iti pL4440 plasmid.Dagiti plasmid constructs ket naala manipud iti NEB 5-α competent E. coli (New England Biolabs) ken naberipika babaen ti DNA sequencing sakbay ti pannakausar (kitaen ti Supplementary Data 1 para iti insert sequence).Dagiti aprimers ket naipada iti T7 promoter (Extended Data Table 2) ket naus-usar a mangpaadu ti insert manipud iti pL4440-based a plasmid.Ti kadakkel ti produkto ti PCR ket napasingkedan babaen ti agarose gel electrophoresis.Ti dsRNA ket naitranskrip manipud kadagiti plantilia ti PCR babaen ti panagusar ti Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ken nadalus segun kadagiti instruksion ti agpartuat babaen dagiti panagbalbaliw a dati a nailadawan.
Para iti dsRNA injection, 1,380 ng ti dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ket nai-inject iti konsentrasion a 10 ng nl-1 iti thorax dagiti nataengan a lallaki wenno kabaian (Nanoject III, Drummond) iti uneg ti 1 nga aldaw kalpasan ti eclosion.Dagiti gene knockdown levels ket naikeddeng iti di kumurang a tallo a biolohikal a replika babaen ti RNA extraction, cDNA synthesis, ken RT-qPCR.Para iti ecdysone injection, dagiti 4-aldaw a birhen wenno 6-aldaw a birhen a nataraonan iti dara a kabaian ket naineksionan iti 0.13, 0.21, wenno 0.63 μg ti 20E wenno 3D20E (Nanoject III, Drummond) iti konsentrasion a 1.3, 2.1, . agpada, depende iti eksperimental a disenio wenno 6.3 ng nl-1.I-inject ti 100 nl ti 10% (vol/vol) nga ethanol iti danum; 100 nl ti 3D20E22P iti 10% ethanol (katupag ti 75% ti kaadu a masarakan iti maysa a paris ti MAGs).Nairana a naituding dagiti lamok iti grupo ti injection.
Para kadagiti spawning assays, dagiti 3-aldaw a kabaian ket nataraonan ad libitum iti dara ti tao.Ikkaten dagiti paset a nataraonan wenno saan a nataraonan a lamok.Depende iti pannakaagas, dagiti kabaian ket naikabil kadagiti agsina a spawning cups iti uppat a rabii di kumurang nga 48 nga oras kalpasan ti pannangan iti dara.Nabilang dagiti itlog iti sidong ti stereoscope (Stemi 508, Zeiss); para kadagiti naasawaan a kabaian, dagiti itlog a nagpisi iti larva ket naibilang a nabunga.
Para kadagiti panagsubok ti panagasawa, dagiti kabaian ket napalubosan iti di kumurang a 2 nga aldaw depende iti panangagas tapno mangpataud ti resistensia iti panagasawa, ken dagiti atap a kita a naitunos ti edad a kalakian ket kalpasanna ket naiserrek iti isu met laeng a hawla.Dua a rabii kalpasanna, dagiti kabaian a napertilisar a vesico ket na-dissect ken ti genomic DNA ket nairuar babaen ti freeze-thaw ken sonication iti maysa a buffer a naglaon iti 10 mM Tris-HCl, . 1 mM EDTA, ken 25 mM NaCl (pH 8.2).Dagiti sample ket naipatakder babaen ti Proteinase K (0.86 μg μl-1) iti 15 a minuto iti 55 °C, a sinaruno babaen ti 10 a minuto iti 95 °C.Dagiti krudo a genomic DNA a panagsagana ket nabartek iti 10-a-mamin-adu ken naipasidong iti qPCR a pannakaduktal dagiti panagsasaruno ti Y chromosome; dagiti primer ket nailista iti Extended Data Table 2.Ti kaawan ti panagsasaruno ti Y chromosome ket mangipakita nga awan ti panagasawa.
Para kadagiti re-mating assays, dagiti force-mated a kabaian ket naeksamen para iti kaadda dagiti mating plugs tapno mapasingkedan ti kasasaad ti panagasawa ken napalubosan ti 2 nga aldaw a mangpadur-as iti refractoriness iti panagasawa no awan dagiti kalakian, kas iti dati a nailadawan 36 .Dagiti kalakian nga agaw-awit iti DsRed transgenic sperm ket kalpasanna naiserrek kadagiti kabaian a hawla.Dua a rabii kalpasanna, dagiti fertilizing vesicles ket na-dissect manipud kadagiti kabaian, ken ti genomic DNA ket naisagana a kas nailadawan iti ngato ken naipasidong iti qPCR a pannakaduktal ti DsRed a transgene; dagiti primers ket nailista iti Extended Data Table 2.Ti kaawan ti DsRed transgene ket nangipamatmat nga awan ti napasamak a panagasawa manen.
Ti 3D20E ket nasintisisar a kas ti dati a nailadawan 37 .Iti apagbiit, ti 10 mg ti 20E (Sigma-Aldrich) ket narunaw iti 10 ml a danum, a sinaruno babaen ti pannakainayon ti 30 mg ti nangisit a platinum (iti porma ti pulbos, Sigma-Aldrich).Ti naalumamay nga ayus ti O2 ket agtultuloy a naburak iti naglaok a reaksion, a napaglalaok iti siled temperatura.Kalpasan ti 6 nga oras, nainayon ti 30 mL a methanol tapno mapasardeng ti reaksion.Ti naglaok ket nasentripugo tapno maikkat dagiti partikulo ti katalista.Ti supernatant ket na-evaporate agingga a namaga iti vacuo iti temperatura ti kuarto.Ti namaga a produkto ti reaksion ket narunaw iti 10% nga ethanol ken methanol para iti panangineksion para iti HPLC-MS/MS analysis.Ti conversion rate (manipud 20E agingga iti 3D20E) ket agarup a 97% ( Fig. 4b ), ken ti MS nga espektro ti nasintisisar a 3D20E ket naipada iti nasarakan kadagiti naasawaan a kabaian ( Fig. 4c ).
Ti sarsarita ket naglaon kadagiti espesipiko a detalye dagiti estadistikal a panagsubok a naaramid.Ti GraphPad (bersion 9.0) ket naus-usar a mangaramid ti eksakto a panagsubok ni Fisher, panagsubok ti Mantel-Cox, ken ti t-panangsubok ti Student.Dagiti panagsubok ti Cochran-Mantel-Haenszel ket naaramid babaen ti panagusar ti kostumbre nga iskrip ti R (magun-od idiay https://github.com/duopeng/mantelhaen.test).Ti pannakaiwaras ti datos ket nasubok para iti normalidad babaen ti panagusar ti Shapiro-Wilk a panagsubok nga addaan iti significance threshold a 0.05.Idi napaay ti datos iti normalidad a panagsubok, ti ​​Mann-Whitney a panagsubok ket naaramid.Ti datos ti panagbiag ket naanalisar babaen ti panagusar ti Mantel-Cox a panagsubok.Ti DESeq2 a pakete (bersion 1.28.1) ket naus-usar a mangaramid ti RNA-seq a gene-level a diferensial nga ebkas a panaganalisar.Ti horizontal a bara iti grapo ket mangibagi ti median.A ti pateg ti kaipapanan ti P = 0.05 ket naus-usar a kas ti pagrukodan para kadagiti amin a panagsubok.
Para iti ad-adu pay nga impormasion maipapan iti disenio ti panagadal, kitaen ti abstrakto ti Nature Research Report a naisilpo iti daytoy nga artikulo.
Ti proteomiko a datos ti MS ket naideposito iti ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) babaen ti PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) nga addaan iti dataset identifier a PXD032157.
Ti RNA-seq a dataset ket naideposito idiay Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) iti baba ti serial a rekord a GSE198665.
Dagiti kanayonan a dataset a napataud ken/wenno naanalisar bayat ti agdama a panagadal ket mabalin a magun-od manipud kadagiti maitunos nga autor no nainkalintegan a kiddaw.Daytoy nga artikulo ket mangipaay ti taudan a datos.
De Loof, A. Dagiti ecdysteroids: Dagiti nabaybay-an nga insekto a sekso nga steroid?Lalaki: Nangisit a Kahon.Siensia ti Insekto.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone ken panagrang-ay ti obario iti Anopheles stephens.J. Pisiolohia ti Insekto.28, 97–109 (1982).