Ti panagurnos ti protina iti sekretarial a dalan ket nasken para iti panangtaginayon ti selula a kompartimentalisasion ken homeostasis. Malaksid iti shell-mediated sorting, ti papel dagiti lipido iti kinesin sorting iti proseso ti secretory transport ket maysa a nabayagen a kangrunaan a saludsod a saan pay a nasungbatan. Ditoy, aramidenmi ti 3D nga aggigiddan a multicolor high-resolution real-time imaging tapno paneknekan iti vivo a dagiti baro a nasintisisar a glycosylphosphatidylinositol-immobilized a protina nga addaan kadagiti atiddog ​​unay a ceramide lipid moieties ket naurnong ken naidasig kadagiti espesial nga endoplasma Net exit site, a naiduma manipud iti inus-usar babaen dagiti transmembrane a protina. Iti pay maipatinayon, ipakitami a ti kaatiddog ​​ti kadena ti ceramide iti endoplasmiko a retikulo a membrane ket kritikal para iti daytoy a panagpili ti panagurnos. Ti panagadalmi ket mangipaay ti umuna a direkta nga in vivo nga ebidensia a mangklasipika kadagiti karga ti protina a naibatay iti kaatiddog ​​ti kadena ti lipido kadagiti mapili a lugar ti panageksport iti sekretario a dalan.
Kadagiti eukaryotic a selula, dagiti protina a naaramid iti endoplasmic reticulum (ER) ket kalpasanna maurnos bayat ti pannakaibiahe babaen ti sekretaria a dalan para iti pannakaitulod iti maitutop a selula a destinasionda (1). Malaksid iti panagurnos babaen ti amerikana, nabayagen a naipagarup a dagiti sumagmamano a lipido ket mabalin pay nga agserbi a kas dagiti mapili a puntos ti panagruar babaen ti panagurnong kadagitoy kadagiti espesipiko a dominio ti membrane a dagiti espesipiko a protina (2-5). Nupay kasta, adda pay laeng ti kinakurang ti direkta nga in vivo nga ebidensia a mangpaneknek iti daytoy a posible a mekanismo a naibatay iti lipido. Tapno masolbar daytoy a kangrunaan a parikut, inadalmi iti lebadura no kasano a dagiti glycosylphosphatidylinositol (GPI) a naisanglad a protina (GPI-APs) ket naiduma a mairuar manipud iti ER. Dagiti GPI-AP ket nadumaduma a lipido-a naikonektar a protina ti rabaw ti selula ( 6, 7). Ti GPI-AP ket maysa a nairuar a protina a naikapet kadagiti akinruar a bulong ti membrane ti plasma babaen ti glycolipid moiety (GPI anchor). Awatenda dagiti angkla ti GPI a kas dagiti konserbatibo a kalpasan ti panagipatarus a panagbalbaliw iti ER lumen (8). Kalpasan ti pannakaikapet, lumasat ti GPI-AP iti Golgi apparatus (5, 9) manipud iti ER agingga iti plasma membrane. Ti kaadda dagiti angkla ti GPI ket mangpataud ti GPI-AP a maibiahe a naisina manipud kadagiti transmembrane a nairuar a protina (a mairaman dagiti dadduma pay a protina ti membrane ti plasma) iti igid ti mairuar a dalan ( 5 , 9 , 10 ). Kadagiti selula ti lebadura, dagiti GPI-AP ket naisina manipud kadagiti sabali a nairuar a protina iti endoplasmiko a retikulo, ken kalpasanna ket naipakete kadagiti naisangayan a vesico a nabalkot babaen ti coat protein complex II (COPII) ( 6 , 7 ). Dagiti determinante daytoy a proseso ti panagklasipika iti proseso ti panageksport ti ER ket saan a nalawag, ngem naipagarup a daytoy a mekanismo ket mabalin a kasapulan dagiti lipido, nangruna ti estruktural a panagmodelo manen ti paset ti lipido ti angkla ti GPI ( 5 , 8 ). Iti lebadura, mangrugi a dagus ti GPI lipid remodeling kalpasan a maikapet ti GPI, ken iti adu a kaso, daytoy ti pakaigapuan ti panagsilpo ti ceramide iti 26-carbon long-chain saturated fatty acid (C26:0) (11, 12). Ti C26 ceramide ti kangrunaan a ceramide a pinataud dagiti selula ti lebadura agingga ita. Daytoy ket nasintisisar iti ER ken kaaduan kadagitoy ket mailaklako iti aparato ti Golgi babaen dagiti COPII a vesico ( 13 ). Ti ER a panageksport ti GPI-AP ket espesipiko a kasapulan ti agtultuloy a sintesis ti ceramide ( 14 , 15 ), ken iti kasumbangirna, ti panagbalbaliw ti ceramide iti inositol phosphate ceramide (IPC) iti aparato ti Golgi ket agpannuray iti GPI anchor synthesis ( 16 ). Dagiti biopisikal a panagadal kadagiti artipisial a membrana ket nangipakita a dagiti atiddog ​​unay nga acyl chain ceramides ket mabalin a agtitipon tapno mangporma kadagiti naurnos a dominio nga addaan kadagiti naisangayan a pisikal a tagikua ( 17 , 18 ). Dagitoy a datos ket mangiturong iti hipotesis a ti C26 a seramida ken ti GPI-AP nga addaan iti C26 a seramida ket agus-usar kadagiti pisikal a tagikuada tapno agtitipon kadagiti naurnos a rehion wenno rehion iti relatibo a nariribuk nga aglawlaw ti lipido ti ER a membrana. Daytoy ket nangruna a buklen dagiti ababa ken saan a napuskol a glicerolipido (C16:1 ken C18:1) (19, 20). Dagitoy a rehion ket mapili a maipamaysa kadagiti espesipiko nga ER exit sites (ERES), a sadiay ti ceramide ken ceramide-based GPI-AP ket mabalin a co-transported iti Golgi iti isu met laeng a naidedikar a COPII vesicle (5).
Iti daytoy a panagadal, direkta a sinubokmi daytoy a lipido-a naibatay a mekanismo babaen ti panagusar ti super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM), nga isu daytoy ket maysa a kabaruan a tekniko ti mikroskopia a mabalin nga aggigiddan a mangpaliiw kadagiti fluorescently labeled a protina Dagiti tallo-kolor ken tallo-dimensional (3D) a ladawan ket addaan iti nangato unay a resolusion ken kapartak kadagiti sibibiag a selula ( 21 , 22 ).
Immuna nga inyaplikarmi ti teknolohia ti SCLIM tapno ad-adda a mangikeddeng no kasano a ti normal a GPI-AP nga addaan iti C26 a grupo ti ceramide ket nai-screen manipud kadagiti transmembrane a nairuar a protina kalpasan ti ipapanaw iti ER iti S. cerevisiae. Tapno masukimat ti pannakaidasig ti ER, nagusarkami iti henetiko a sistema a direkta a makailadawan iti baro a nasintisisar a karga a sumrek iti ERES iti vivo ( 7 , 23 ). Kas karga, pinilimi ti C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 a naimarka iti berde a fluorescent protein (GFP) ken transmembrane secreted protein Mid2 a naimarka iti near-infrared fluorescent protein (iRFP), nga agpada a puntiria ti plasma membrane ( 24–26 ). Iti sec31-1 a temperatura-sensitibo a mutante, dagitoy dua a karga ket naiyebkas iti sidong ti galactose-inducible a promotor ken ti konstitutibo nga ERES a markador. Iti nalabes a temperatura (37°C), gapu ta ti sec31-1 a mutasion ket mangapektar ti panagandar ti COPII a paset ti amerikana a Sec31 tapno manglapped ti panagtubo ti COPII ken panageksport ti ER, dagiti baro a nasintisisar a karga ket maurnong idiay ER (23). Kalpasan ti panaglamiis iti nababa a temperatura (24°C), dagiti sec31-1 a mutante a selula ket nakasubli manipud iti sekretaria a lugar, ken dagiti naurnong a baro a sintetiko a karga ket nangrugi a nailako manipud iti ER. Impakita ti CLIM a panagbuya a kaaduan kadagiti baro a nasintisisar a Gas1-GFP ken Mid2-iRFP ket naurnong pay laeng iti ER dagiti sec31-1 a mutante a selula kalpasan ti panaginkubasion iti 37°C ken kalpasanna nairuar iti 24°C iti 5 a minuto (Pigura 1). Gapu ta ti Mid2-iRFP ket naiwarwaras iti sibubukel nga ER a membrane, ken ti Gas1-GFP ket naikonsentrar ken naurnong iti saan nga agtultuloy a lugar ti ER a membrane, ti pannakaiwarasda ket naan-anay a naiduma (Pigura 1, A aginggana iti C ken Pelikula S1). Iti pay maipatinayon, kas naipakita iti Figura 1D, ti Gas1-GFP a gunglo ket awan ti Mid2-iRFP. Dagitoy a resulta ket mangipakita a dagiti protina ti GPI-AP ken transmembrane ket naisina kadagiti nadumaduma a rehion ti ER membrane a nasapa. Ti Gas1-GFP a gunglo ket kabangibang ti espesipiko nga ERES a naimarka iti COPII a kabal a protina ti mCherry a Sec13 (Pigura 1, E ken F, ken pelikula S1) (23).
dagiti selula ti sec31-1 ket mangiyebkas kadagiti galaktosa-a naiduron a panagibukbok, ti ​​atiddog ​​nga asil a kadena (C26) a ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, berde) ken ti transmembrane a protina a Mid2-iRFP (TMP, asul) ken daytoy a Konstruktibo nga ERES a panagmarka ti Sec13-mCherry (ERES, magenta) ket naipatakder iti 37°C iti 30 a minuto, nayakar iti 24°C, ken nailadawan babaen ti SCLIM 5 a minuto kalpasanna. (A aginggana ti C) ket mangipakita ti pannakabagi a naikaykaysa wenno agmaymaysa a 2D a ladawan ti maysa a plano (A), ti 2D a proyeksion a ladawan ti 10 a z-seksion (B) wenno ti 3D a selula a hemispero a ladawan ti karga ken dagiti markador ti ERES (C). Barra ti timbangan 1μm (A ken B). Ti yunit ti timbangan ket 0.551μm (C). Ti Gas1-GFP ket naduktalan kadagiti diskreto nga ER a rehion wenno dagiti gunglo, bayat a ti Mid2-iRFP ket naduktalan ken naiwarwaras iti intero nga ER a membrane (C). (D) Ti grapo ket mangipakita ti relatibo a kapigsa ti fluorescence ti Gas1-GFP ken Mid2-iRFP iti Gas1-GFP a gunglo iti igid ti puraw a linia ti pana (kannigid). AU, arbitrario nga yunit. (E ken F) irepresentarda ti 3D a ladawan a mangtipon kadagiti tagilako ken marka ti ERES. Naduktalan dagiti Gas1-GFP clusters iti asideg ti espesipiko nga ERES. Ti yunit ti timbangan ket 0.551μm. (F) Ti puraw a solido a pana ket mangmarka ti Gas1-GFP cluster a nainaig iti ERES. Ti tengnga ken kannawan a panel ket mangipakita ti naikaykaysa a napadakkel a 3D a ladawan ken ti naiturong a panagkita ti napili a Gas1-GFP a gunglo.
Ti asideg nga espasial a relasion iti nagbaetan ti Gas1-GFP a gunglo ken ti espesipiko nga ERES ket mangipakita a ti Gas1-GFP ket mabalin a sumrek iti mapili nga ERES, a naiduma manipud iti panagpili nga inus-usar babaen ti Mid2-iRFP tapno pumanaw iti ER. Tapno maiturong daytoy a posibilidad, kinantipikarmi ti ERES ratio para laeng iti maysa wenno dua a tagilako (Pigura 2, A agingga iti C). Natakuatanmi a kaaduan nga ERES (70%) ket naglaon iti maysa laeng a kita ti karga. Ti baba a ladawan ti Figura 2C ket mangipakita ti dua a gagangay a pagarigan ti ERES nga addaan laeng iti Gas1-GFP (Pigura 1) wenno Mid2-iRFP laeng (Pigura 2). Iti kasumbangirna, agarup 20% ti ERES ti naglaon iti dua a karga nga agtupak iti isu met laeng a lugar. Natakuatan a dadduma nga ERES (10%) ti naglaon iti dua a kita ti karga, ngem naisina dagitoy iti nalawag a nagduduma a lugar. Gapuna, daytoy nga estadistikal nga analisar ket mangipakita a kalpasan ti pannakailako ti ER, ti GPI-AP Gas1-GFP ken ti transmembrane a karga a Mid2-iRFP ket nabingbingay kadagiti nadumaduma nga ERES (Pigura 2D). Daytoy nga episiensi ti panagurnos ket maitunos unay iti napalabas a biokemikal a panaganalisar (6) ken morpolohiko a panangikeddeng (7). Mabalintayo pay a paliiwen ti kababalin dagiti na-quarantine a karga a sumsumrek iti ERES (Figure 2E ken Movie S2). Ipakita ti Figure 2E a bassit laeng a paset ti Gas1-GFP (panel 3) wenno Mid2-iRFP (panel 4) ti sumrek iti ERES manipud iti maysa a sikigan ken naikulong iti diskreto a lugar. Ipakita ti Panel 5 ti Figura 2E a ti Gas1-GFP ken Mid2-iRFP ket sagpaminsan a masarakan iti agpada nga ERES, ngem sumrekda manipud kadagiti nadumaduma a sikigan ken naikonsentrar kadagiti agsina a rehion a mabalin a mangibagi kadagiti nadumaduma a vesico ti COPII. Pinasingkedanmi pay a ti napaliiw a panagsina ken pannakaidasig ti C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 kas mapili nga ERES ket espesipiko gapu ta ti sabali pay a transmembrane secretion cargo, ti GFP-tagged a plasma membrane protein Axl2 (27 ), a mangipakpakita iti kapada a kababalin iti Mid2-iRFP. (Ladawan S1 ken Pelikula S3). Ti baro a nasintisisar nga Axl2-GFP ket naiwarwaras babaen ti ER a membrane a kas ti Mid2-iRFP (Pigura S1, A ken B), ken co-localized iti Mid2-iRFP iti kaaduan nga ERES (Pigura S1, B aginggana iti D). Panel 1 ken 2 ti Figure 1. Ipakita ti S1C ti dua a gagangay a pagarigan ti ERES a sadiay dua a transmembrane cargoes ti agtuon. Kadagitoy a kaso, agpada a sumrek dagiti tagilako iti ERES a sangsangkamaysa (Pigura S1E, Panel 3 ken Pelikula S3).
Dagiti selula ti sec31-1 a mangipakpakita kadagiti galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) ken Mid2-iRFP (TMP, asul) ken konstitutibo nga ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) ket naikabil iti 37 Kalpasan ti panaginkubasion iti 30 a minuto iti °C, umakar iti 24 °C tapno mairuar ti secretion block, ken imahe babaen ti SCLIM kalpasan 20 a minuto. (A agingga iti C) Dagiti pannakabagi a ladawan ti 2D a proyeksion (A; bara ti sukog, 1μm) wenno dagiti ladawan ti hemispero ti selula ti 3D (B ken C; yunit ti sukog, 0.456μm) ti karga ken 10 a z-seksion a namarkaan babaen ti ERES. Ti nababbaba a panel iti (B) ken ti panel iti (C) ket mangipakpakita kadagiti naproseso a ladawan tapno maipakita laeng dagiti tagilako nga adda iti ERES (magenta) [Gas1-GFP (abuabu) ken Mid2-iRFP (nalawag nga asul)]. (C) Open arrow: Maysa laeng a pedaso ti karga (1 agingga iti 4) ti awit ti ERES. Gray arrow: Naglaon ti ERES kadagiti naisina a karga (5). Puraw a solido a pana: ERES a naglaon iti co-located cargo. Iti baba: Ti napili a maymaysa nga ERES ket naglaon laeng iti Gas1-GFP (1) wenno Mid2-iRFP (2). Bar ti timbangan, 100 nm. (D) Panangkuantipikar ti photomicrograph a nailadawan iti (C). Ti promedio a porsiento ti ERES a naglaon laeng iti maysa a karga (Gas1-GFP wenno Mid2-iRFP), naisina a karga ken agtupak a karga. Iti tallo nga agwaywayas nga eksperimento, n=432 iti 54 a selula. Bar ti biddut = SD. Dua ti ipusna nga unpaired t test. *** P = 0.0002 nga. (E) 3D image ti napili nga ERES ti quarantine cargo a namarkaan iti (C). Ti Gas1-GFP (berde) (3) wenno Mid2-iRFP (asul) (4) ket sumrek iti ERES (magenta) manipud iti maysa a sikigan ken nainget iti bassit a lugar iti uneg ti ERES. No dadduma, agpada a sumrek ti agpada a kita ti karga iti isu met laeng nga ERES (5) manipud iti isu met laeng a sikigan ken naikulong iti naiputputong a lugar iti uneg ti ERES. Bar ti timbangan, 100 nm.
Sumaganad, sinubokmi ti maysa a hipotesis a ti atiddog ​​nga acyl chain ceramide (C26) a presente iti ER a membrane ket mangiturong ti espesipiko a panagurnong ken panagurnos ti Gas1 iti mapili nga ERES. Iti daytoy a panggep, nagusarkami iti nabaliwan a kita ti lebadura a GhLag1, a dagiti dua nga endoheno a ceramide synthases a Lag1 ken Lac1 ket nasukatan babaen ti GhLag1 (ti Lag1 a homologo ti kapas), a nagresulta iti maysa a kita ti lebadura nga addaan iti selula a membrane a kita ti Ceramide nga ababa ngem ti atap a kita (Pigura 3A) (28). Impakita ti panaganalisar ti mass spectrometry (MS) nga kadagiti atap a kita, 95% iti dagup a ceramide ket atiddog ​​unay (C26) a kadena a ceramide, bayat nga iti GhLag1, 85% ti ceramide ket atiddog ​​unay (C18 ken C16). ), 2% laeng ti ceramide ti atiddog ​​unay (C26) a kadena a ceramide. Urayno dagiti C18 ken C16 a seramida ket dagiti kangrunaan a seramida a naduktalan iti GhLag1 a membrane aginggana ita, ti panaganalisar ti MS ket nagpasingked pay a ti GPI nga angkla ti Gas1-GFP a naiyebkas iti GhLag1 a kita ket aglaon ti C26 a seramida, a maipada kadagiti atap a tipo a lipido. Agpada ti kalidad (Fig. 3A) (26). Gapuna, daytoy ket kayatna a sawen a ti ceramide remodeling enzyme a Cwh43 ket nangato a mapili para iti C26 ceramide, a kas naipakita iti Figura 26, daytoy ket kaykayatna a mangikabil ti GPI nga angkla manipud iti bassit a kaadu ti C26 ceramide iti GhLag1 a kita. S2 (29) nga . Nupay kasta, ti selula a membrane ti GhLag1 ket kangrunaan laeng nga aglaon ti C18-C16 a seramida, bayat a ti Gas1-GFP ket addaan pay laeng ti C26 a seramida. Daytoy a kinapudno ket mangaramid daytoy a kita a maysa a nasayaat nga alikamen tapno espesipiko a mangrisut ti parikut ti kaatiddog ​​ti kadena ti asil ti membrane ceramide iti ER. Ti hipotetiko nga akem ti klase ken panagurnos. Kalpasanna, immuna nga inadalmi ti abilidad ti C26 Gas1-GFP nga agurnong kadagiti gunglo iti GhLag1 nga addaan iti temperatura-sensitibo a mutant allele ti sec31-1 babaen ti gagangay a fluorescence microscopy, a sadiay ti laeng atiddog ​​(C18-C16) a kadena ti adda iti ER membrane Ceramide ( Fig. 3 ). Napaliiwmi nga iti sec31-1, kaaduan ti Gas1-GFP ket naikonsentrar kadagiti gunglo, bayat a ti Gas1-GFP iti sec31-1 GhLag1 nga addaan iti atiddog ​​(C18-C16) nga atiddog ​​a ceramide ER a membrane ket nangruna a saan a naurnong ken naiwarwaras iti Iti intero nga ER a membrane. Tapno eksakto, gapu ta ti C26 ceramide-based clustering ket asideg a nainaig iti espesipiko nga ERES (Pigura 1), simmaruno a sinukimatmi no daytoy a proseso ket mabalin pay a mairaman ti panagandar ti ER export protein mechanism. Ti GPI-AP ket agus-usar ti naisangayan a sistema ti COPII para iti panageksport ti ER, nga aktibo a nairegula babaen ti Ted1′s nga estruktural a panagmodelo manen ti paset ti glycan ti GPI nga angkla ( 30 , 31 ). Ti rekombinante a GPI-glycan ket kalpasanna ket mabigbigan babaen ti transmembrane a karga a reseptor a p24 a komplikado, a daytoy ket mapili a mangrekrut ti Lst1, nga isu daytoy ket maysa nga espesipiko nga isoporma ti nangruna a COPII a karga a mangisilpo a subunit a Sec24, a mangporma ti maysa a GPI-AP-nabaknang a COPII Dagiti vesico ket kasapulan (31-33). Gapuna, nangaramidkami iti doble a mutante a nangtipon iti pannakaikkat dagitoy nga agmaymaysa a protina (ti p24 a komplikado a paset ti Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 ken ti espesipiko a COPII a subunit Lst1) iti sec31-1 a mutante a kita, ken inadalmi dagitoy Posible kadi a mangporma iti Gas1-cluster GFP (Pigura 3). Napaliiwmi nga iti sec31-1emp24Δ ken sec31-1ted1Δ, ti Gas1-GFP ket nangruna a saan a naurnong ken naiwarwaras iti intero nga ER a membrane, a kas ti dati a nakita iti sec31-1 GhLag1, bayat nga iti sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Kas iti sec31-1. Dagitoy a resulta ket mangipakita a malaksid ti kaadda ti C26 a seramida iti ER a membrane, ti panagurnong ti Gas1-GFP ket kasapulan pay a mangisilpo iti p24 a komplikado, ken saan a kasapulan ti espesipiko a panagrekrut ti Lst1. Kalpasanna, sinukimatmi ti posibilidad a ti kaatiddog ​​ti kadena ti ceramide iti ER a membrane ket mabalin a mangregula ti panagsilpo ti Gas1-GFP iti p24. Nupay kasta, nasarakanmi a ti kaadda ti C18-C16 ceramide iti membrane ket saan nga apektaran dagiti GPI-glycans a binangon manen babaen ti p24 complex (Pigura S3 ken S4, A ken B) wenno panagsilpo iti GPI-AP ken panageksport iti GPI-AP. abilidad. Rekrut ti COPII a subtipo Lst1 (Pigura S4C). Gapuna, ti C26 ceramide-a nakadepende a panagurnong ket saan a kasapulan dagiti panagtitinnulong ti protina kadagiti nadumaduma nga ER a panageksport a mekanismo ti protina, ngem mangsuporta ti alternatibo a mekanismo ti panagurnos a naiturong babaen ti kaatiddog ​​ti lipido. Kalpasanna, inanalisarmi no ti kaatiddog ​​ti kadena ti ceramide acyl iti ER a membrane ket napateg para iti epektibo a pannakaidasig ti Gas1-GFP a kas mapili nga ERES. Gapu ta ti Gas1 iti GhLag1 a kita nga addaan iti ababa a kadena a ceramide ket pumanaw iti ER ken sumrek iti plasma a membrane (Pigura S5), patienmi a no ti panagurnos ket maiturong babaen ti kaatiddog ​​ti ceramide acyl chain, ti Gas1 iti GhLag1 a kita ket mabalin a maiturong manen ken maballasiw. ERES goods nga addaan iti isu met laeng a membrane.
(A) Ti selula a membrane ti GhLag1 ket kangrunaan nga aglaon kadagiti ab-ababa a C18-C16 a seramida, bayat a ti GPI nga angkla ti Gas1-GFP ket addaan pay laeng ti isu met laeng a C26 IPC a kas dagiti atap a kita ti selula. Iti ngato: panaganalisar ti kaatiddog ​​ti kadena ti asil ti ceramide iti selula a membrane dagiti atap a kita (Wt) ken GhLag1p a kita babaen ti mass spectrometry (MS). Irepresentar ti datos ti porsiento ti dagup a ceramide. Ti promedio ti tallo nga agwaywayas nga eksperimento. Bar ti biddut = SD. Dua ti ipusna nga unpaired t test. **** P <0.0001 nga. Bottom panel: MS analysis ti kaatiddog ​​ti acyl chain ti IPC nga adda iti Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI anchor a naiyebkas kadagiti wild-type ken GhLag1p strains. Ti datos ket mangibagi ti porsiento ti dagup nga IPC signal. Promedio ti lima nga agwaywayas nga eksperimento. Bar ti biddut = SD. Dua ti ipusna nga unpaired t test. ns, saan a napateg. P = 0.9134 nga. (B) Dagiti mikrograpo ti fluorescence ti sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ken sec31-1lst1Δ a selula a mangipakpakita ti galactose-induced Gas1-GFP ket naipatakder iti 37°C iti 30 a minuto ken naipasa iti baba tapno Mangaramid ti gagangay a mikroskopia ti fluorescence kalpasan 24°C nga . Puraw a pana: ER Gas1-GFP a gunglo. Silulukat a pana: Ti saan a naurnong a Gas1-GFP ket naiwarwaras iti sibubukel nga ER a membrane, a mangipakpakita ti ER a naisangsangayan a nuklear a singsing a panagmantsa. Bar ti timbangan, 5μm. (C) Panangkuantipikar iti photomicrograph a nailadawan iti (B). Ti promedio a porsiento dagiti selula nga addaan iti punctate Gas1-GFP nga estruktura. Iti tallo nga agwaywayas nga eksperimento, n≥300 a selula. Bar ti biddut = SD. Dua ti ipusna nga unpaired t test. **** P <0.0001 nga.
Tapno direkta a marisut daytoy a parikut, inaramidmi ti SCLIM a panagbuya ti Gas1-GFP ken Mid2-iRFP iti GhLag1 nga addaan iti sec31-1 a temperatura-sensitibo a mutant allele ( Figura 4 ken Pelikula S4 ). Kalpasan a ti ER ket natengngel iti 37°C ken kalpasanna ket nairuar iti 24°C, kaaduan kadagiti baro a nasintisisar a Gas1-GFP ket saan a naurnong ken naiwarwaras iti intero nga ER a membrane, a kas napaliiw babaen dagiti gagangay a mikroskopio (Pigura 4, A ken B ). Mainayon pay, ti dakkel a porsiento ti ERES (67%) ket mangiraman ti dua a kita ti karga a co-located iti daytoy (Pigura 4D). Dagiti panel 1 ken 2 ti Figura 4C ket mangipakita ti dua a gagangay a pagarigan ti ERES nga addaan iti agtuon a Gas1-GFP ken Mid2-GFP. Mainayon pay, agpada a narekrut dagiti tagilako iti isu met laeng nga ERES (Pigura 4E, panel 3 ken pelikula S4). Gapuna, dagiti resultami ket mangipakita a ti kaatiddog ​​ti kawar ti ceramide acyl iti ER a membrane ket maysa a napateg a determinante ti panagtitipon ken pannakaidasig ti protina ti ER.
Dagiti selula ti Sec31-1 GhLag1 a mangipakpakita kadagiti galactose-a naiduron a panagibukbok, Gas1-GFP (GPI-AP, berde) ken Mid2-iRFP (TMP, asul) ken konstitutibo nga ERES-nailatak a Sec13-mCherry (ERES, magenta) Agpaadu iti 37°C. Ituloy iti 30 a minuto, bumaba iti 24°C tapno mairuar dagiti sekresion, ken imahe babaen ti SCLIM kalpasan ti 20 a minuto. (A aginggana iti C) Dagiti pannakabagi a ladawan ti 2D a proyeksion (A; bara ti sukog, 1μm) wenno dagiti ladawan ti hemispero ti selula ti 3D (B ken C; yunit ti sukog, 0.45μm) dagiti 10 a z-seksion a namarkaan babaen ti karga ken ERES. Ti nababbaba a panel iti (B) ken ti panel iti (C) ket mangipakpakita kadagiti naproseso a ladawan tapno maipakita laeng dagiti tagilako nga adda iti ERES (magenta) [Gas1-GFP (abuabu) ken Mid2-iRFP (nalawag nga asul)]. (C) Puraw a napno a pana: ERES, agtupak dagiti tagilako. Open arrow: Maymaysa laeng ti linaon ti ERES. Makinbaba a panel: Ti napili nga ERES ket addaan kadagiti agtupak a tagilako (1 ken 2) a namarkaan iti (C). Bar ti timbangan, 100 nm. (D) Panangkuantipikar ti photomicrograph a nailadawan iti (C). Iti sec31-1 ken sec31-1 a yunit ti GhLag1, maysa laeng a karga (Gas1-GFP wenno Mid2-iRFP) ti nairaman, ken ti promedio a porsiento ti ERES para kadagiti naisina a karga ken agtuon a karga. Iti tallo nga agwaywayas nga eksperimento, n = 432 kadagiti 54 a selula (sec31-1) ken n = 430 kadagiti 47 a selula (sec31-1 GhLag1). Bar ti biddut = SD. Dua ti ipusna nga unpaired t test. *** P = 0.0002 (sec31-1) ken ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1) ket 10002. (E) 3D a ladawan ti napili nga ERES nga addaan iti agsasabtan a karga (3) a namarkaan iti (C). Ti Gas1-GFP (berde) ken Mid2-iRFP (asul) ket umasideg iti ERES (magenta) manipud iti isu met laeng a sikigan ken agtalinaed iti isu met laeng nga ERES a nainget a lugar. Bar ti timbangan, 100 nm.
Daytoy a panagadal ket mangipaay ti direkta nga in vivo nga ebidensia a dagiti karga ti protina a naibatay iti lipido ket naidasig kadagiti mapili a lugar ti panageksport iti sekretarial a dalan, ken ipalgakna ti kinapateg ti kaatiddog ​​ti kadena ti asil para iti panagpili ti pannakaidasig. Babaen ti panagusar ti nabileg ken kabaruan a tekniko ti mikroskopia a tinawtawagan iti SCLIM, impakitami ti baro a nasintisisar a Gas1-GFP (maysa a kangrunaan a plasma membrane GPI-AP nga addaan iti atiddog ​​unay nga acyl chain (C26) ceramide lipid portion) iti lebadura ) Dagiti rehion a naurnong kadagiti diskreto nga ER ket nainaig kadagiti espesipiko nga ERES, bayat a dagiti transmembrane a nairuar a protina ket naiwarwaras iti intero nga ER membrane (Pigura 1). Mainayon pay, dagitoy dua a kita ti tagilako ket sumrekda iti nadumaduma nga ERES a mapili (Pigura 2). Ti kaatiddog ​​ti acyl chain ti selula a ceramide iti membrane ket naikkat manipud iti C26 aginggana iti C18-C16, ti Gas1-GFP a gunglo ket nasinga iti diskreto nga ER a rehion, ken ti Gas1-GFP ket naiturong manen tapno pumanaw iti ER nga addaan iti transmembrane a protina babaen ti isu met laeng nga ERES (Pigura 3 ken Figura 3). 4).
Urayno ti GPI-AP ket agus-usar ti naisangayan a mekanismo ti protina tapno rummuar iti ER, nasarakanmi a ti C26 a seramida-a-nagdepende a panagsisina ket saan nga agpannuray kadagiti naidumaduma a panagtitinnulong ti protina a mabalin a mangiturong iti espesialisasion ti ERES (Pigura S4 ken S5). Imbes ketdi, dagiti natakuatanmi ket mangsuporta ti alternatibo a mekanismo ti panagklasipika a tinignay babaen ti lipid-based a panagurnong ti protina ken ti simmaruno a pannakailaksid dagiti sabali a karga. Dagiti panagpalpaliiwmi ket mangipakita a ti rehion ti Gas1-GFP wenno gunglo a nainaig iti maysa nga espesipiko nga ERES ket awanan iti transmembrane a naibukbok a protina a Mid2-iRFP, a mangipakita a ti C26 ceramide-a nakadepende a GPI-AP a gunglo ket mangpasayaat ti iseserrekda iti mainaig nga ERES, ken iti isu met laeng a panawen, mailaksid ti transmembrane Dagiti panagruar ket sumrek iti daytoy a partikular nga ERES (Pigura 1 ken 2). Iti kasumbangirna, ti kaadda dagiti C18-C16 a seramida iti ER a membrane ket saan a mangpataud ti GPI-AP a mangporma kadagiti rehion wenno gunglo, isu a dida ilaksid wenno sukatan dagiti transmembrane a nairuar a protina iti isu met laeng nga ERES (Pigura 3 ken 4). . Gapuna, isingasingmi a ti C26 a seramida ket mangiturong ti panagsisina ken panagklasipika babaen ti panangipalubos ti panagurnong dagiti protina a naisilpo kadagiti espesipiko nga ERES.
Kasano a maragpat daytoy a C26 ceramide-dependent clustering iti espesipiko nga ER area? Ti pagannayasan ti membrane ceramide nga agsina iti lateral ket mabalin a mangpataud ti GPI-AP ken C26 ceramide a mangporma kadagiti babassit ken giddato a naurnos a lipido iti ad-adu nga iregular a lipido nga aglawlaw ti ER membrane a naglaon kadagiti ab-ababa ken saan a napuskol a glycerolipids. Dagiti gunglo ti kalidad (17, 18). Dagitoy a babassit a temporario a gunglo ket mabalin nga ad-adda a maitipon kadagiti dakdakkel, ad-adda a natalinaay a gunglo kalpasan ti panagsilpo iti p24 a komplikado ( 34 ). Maitunos iti daytoy, impakitami a ti C26 Gas1-GFP ket kasapulan a makilangen iti p24 a komplikado tapno mangporma kadagiti dakdakkel a makita a gunglo (Pigura 3). Ti p24 a komplikado ket maysa a heterozigoto nga oligomero a buklen dagiti uppat a nadumaduma a p24 a transmembrane a protina iti lebadura ( 35 ), a mangipaay ti multibalente a panagsilpo, a mabalin a mangiturong iti panagsilpo ti krus dagiti babassit a GPI-AP a gunglo, iti kasta ket mangpataud ti dakdakkel a Natalged a gunglo ( 34 ). Ti panagtitinnulong ti nagbaetan dagiti protina nga ectodomains dagiti GPI-AP ket mabalin pay a makatulong iti panagtitiponda, a kas naipakita bayat ti panagitulodda iti Golgi kadagiti mamalia a polarisado nga epitelial a selula ( 36 ). Nupay kasta, no ti C18-C16 a seramida ket adda iti ER a membrane, no ti p24 a komplikado ket agsilpo iti Gas1-GFP, dagiti dadakkel a naisina a gunglo ket saan a maporma. Ti naibatay a mekanismo ket mabalin nga agpannuray kadagiti espesipiko a pisikal ken kemikal a tagikua ti atiddog ​​nga acyl chain ceramide. Dagiti biopisikal a panagadal kadagiti artipisial a membrana ket mangipakita a nupay agpada a dagiti atiddog ​​(C24) ken ababa (C18-C16) nga acyl chain ceramides ket mabalin a mangpataud ti panagsina ti paset, dagiti laeng atiddog ​​nga acyl chain ceramides (C24) ket mabalin a mangitandudo ti nangato a Kurbada ken panagkurba ti pelikula tapno mangporma manen ti pelikula. Babaen ti agsinnumbangir a reperensia (17, 37, 38). Naipakita a ti transmembrane helix ti TMED2, ti tao a homologo ti Emp24, ket mapili a makilanglangen iti C18 ceramide-based sphingomyelin kadagiti cytoplasmic lobules ( 39 ). Babaen ti panagusar kadagiti molekular a dinamika (MD) a panagsimula, nasarakanmi nga agpada a dagiti C18 ken C26 a seramida ket maurnong iti aglawlaw dagiti sitoplasmiko a lobulo ti Emp24 transmembrane helix, ken dagitoy ket addaan kadagiti kapada a kaykayat (Pigura S6). Maipalagip a daytoy ket mangipakita a ti transmembrane helix ti Emp24 ket mabalin a mangiturong iti asimetriko a pannakaiwaras dagiti lipido iti membrane. Daytoy ket nabiit pay a resulta a naibatay kadagiti selula ti mamalia. Dagiti umasping nga MD simulations ket mangipakita pay ti kaadda dagiti ether lipids (40) . Gapuna, pattapattaenmi a ti C26 ceramide iti dua a lobules ti ER26 ket lokal a napabaknang. No ti GPI-AP kadagiti luminal a lobulo ket direkta a makisilpo iti multibalente a p24 ken ti panagurnong ti C26 a seramida iti aglawlaw ti p24 kadagiti sitoplasmiko a lobulo, daytoy ket mabalin a mangitandudo ti kakuykuyog a panagtitipon ti Protina ken ti kurbada ti membrana ket mapataud babaen dagiti ramay ( 41 ), a mangpataud ti GPI-AP a mangisina kadagiti diskreto a rehion a kaabay ti ERES, a daytoy ket pabor pay kadagiti nangato a kurbada rehion ti ER membrane ( 42 ). Dagiti napalabas a report ket sinuportaranda ti naisingasing a mekanismo ( 43 , 44 ). Ti multivalent a panagsilpo dagiti oligolectins, patoheno wenno antibody kadagiti ceramide-based glycosphingolipids (GSL) iti plasma membrane ket mangtignay ti dakkel a panagtitipon ti GSL, mangpasayaat ti panagsina ti paset ken mangpataud ti panagporma ti membrane ken internalisasion ( 44 ). Iwabuchi kdpy dagiti neutropilo.
Kadagiti mamalia a polarized epithelial cells, ti konsentrasion ti anti-Golgi network (TGN) iti lebel ti apical plasma membrane ket mangkonkontrol ti panagsina ken panagurnos ti GPI-AP ( 10 , 45 ). Daytoy a panagtitipon ket maiturong babaen ti GPI-AP nga oligomerizasion ( 36 ), ngem mabalin pay nga agpannuray daytoy iti kaatiddog ​​ti kadena ti ceramide a masarakantayo iti lebadura. Urayno ti mamalia a GPI-AP ket addaan iti ether lipid-based anchor, ken ti kemikal nga estrukturana ket naiduma unay manipud iti atiddog ​​unay nga acyl chain ceramide, ti maysa a nabiit pay a panagadal ket nakasarak nga agpada a dagiti lipido ket addaan iti ebolusionario nga agpapada a pisikal ken kemikal a tagikua Ken panagandar ( 40 ). Gapuna, ti paset ti eter a lipido kadagiti selula ti mamalia ket mabalin a kapada ti C26 a seramida iti lebadura, ken ti papelna ket makikadua iti atiddog ​​a kadena a seramida iti membrane tapno mangitandudo ti panagtitipon ken panagurnos ti GPI-AP. Urayno daytoy a posibilidad ket kasapulan pay laeng a masubok a direkta, dagiti napalabas a naduktalan ket mangsuporta a ti panagitulod ti atiddog ​​nga asil a kadena a ceramide iti bagi ti Golgi ket saan a maaramid babaen dagiti sitoplasmiko a panagiyakar a protina, ngem agpannuray iti sintesis dagiti GPI nga angkla a kas ti lebadura. Gapuna, ti ebolusionario a konserbatibo a mekanismo ket kasla makabael a mapili a makipagbiahe iti atiddog ​​unay nga asil a kadena a seramida ken GPI-AP ( 13 , 16 , 20 , 46 , 47 ) iti isu met laeng a vesico ti panagitulod.
Kadagiti lebadura ken mamalia a polarized epithelial cell systems, ti panagtitipon ti GPI-AP ken panagsina manipud kadagiti sabali a protina ti membrane ti plasma ket mapasamak amin sakbay a makadanon iti rabaw ti selula. Paladino ken dagiti kakaduana. (48) ket nakasarak nga iti TGN dagiti mamalia a napolarisado nga epitelio a selula, ti GPI-AP a panagurnong ket saan laeng a kasapulan para iti mapili a pannakaidasig dagiti GPI-AP iti apical a plasma a membrane, ngem mangregula pay ti panagurnong nga organisasion dagiti GPI-AP ken ti biolohiko nga aktibidadna. Rabaw ti selula. Iti lebadura, daytoy a panagadal ket nangipakita a ti C26 ceramide-a nakadepende a GPI-AP a gunglo iti ER ket mabalin a mangregula ti organisasion ti gunglo ken ti panagandar nga aktibidad ti GPI-AP iti plasma a membrane ( 24 , 49 ). Maitunos iti daytoy a modelo, dagiti selula ti GhLag1 ket allergic kadagiti GPI inhibitor wenno dagiti agas a mangapektar iti integridad ti diding ti selula ( 28 ), ken ti panagkasapulan kadagiti agtigtignay a Gas1-GFP a gunglo ( 49 ) ti murdong a ceramide a naiproyekto iti panagasawa dagiti selula ti lebadura ket mangipakita iti G Posible a pisiolohikal a pagbanagan dagiti selula ti hLag1. Biddut ti GPI-AP. Nupay kasta, ti kanayonan a panangsubok no ti panagandar nga organisasion ti rabaw ti selula ket naiprograma manipud iti ER babaen ti pamay-an ti panagurnos a naibatay iti kaatiddog ​​ti lipido ti suheto ti masanguanan a panagsiraraktayo.
Dagiti kita ti Saccharomyces cerevisiae a naus-usar iti daytoy nga obra ket nailista iti Tabla S1. Dagiti MMY1583 ken MMY1635 a kita ti SCLIM para iti sibibiag a selula a panagimahe ket naibangon iti likudan ti W303. Dagitoy a kita a mangiyebkas ti Sec13-mCherry nga addaan iti fluorescent protein tag ket naaramid babaen ti panagusar ti polymerase chain reaction (PCR)-a naibatay a pamay-an nga addaan iti pFA6a a plasmid a kas ti plantilia ( 23 ). Ti kita a mangiyebkas ti Mid2-iRFP a naimarka babaen ti fluorescent a protina iti sidong ti kontrol ti GAL1 a promotor ket nabangon a kas ti sumaganad. PCR a panagpaadu ti iRFP-KanMx a panagsasaruno manipud iti pKTiRFP-KAN a vektor (sagut ni E. O'Shea, Addgene a numero ti plasmid 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; panagsukisok a rekurso a mangilasin (RRID): Addgene_64687) Ken naikabil iti C-terminus ti endoheno a Mid2. Kalpasan a ti Mid2-iRFP a panagsasaruno ti genome ket naamplifikar ken naiklon iti GAL1 a promotor, daytoy ket naikaykaysa iti Not I-Sac I a lugar ti panagtipon a plasmid a pRS306. Ti nagbanagan a plasmid a pRGS7 ket na-linearize iti Pst I tapno maitipon iti URA3 a lokus.
Ti Gas1-GFP a panagtipon a gene ket naiyebkas babaen ti kontrol ti GAL1 a promotor iti centromero (CEN) a plasmid, a nabangon a kas ti sumaganad. Ti panagsasaruno ti Gas1-GFP ket naamplifikar babaen ti PCR manipud iti pRS416-GAS1-GFP a plasmid (24) (sagut ni L. Popolo) ken naiklon iti Xma I–Xho I a lugar ti CEN a plasmid a pBEVY-GL LEU2 (sagut ti C) . Miller, ken ni Miller; Addgene a numero ti plasmid 51225; http://n2t.net/addgene: 51225, Ti panagrang-ay ti panagbiag ti tao; RRID: Addgene_51225) nga . Ti nagbanagan a plasmid ket napanaganan iti pRGS6. Ti Axl2-GFP a panagtipon a gene ket naiyebkas pay babaen ti kontrol ti GAL1 a promotor ti pBEVY-GL LEU2 a vektor, ken ti pannakaibangonna ket kas ti sumaganad. Ti panagsasaruno ti Axl2-GFP ket naamplifikar manipud iti pRS304-p2HSE-Axl2-GFP a plasmid (23) babaen ti PCR, ken naiklon iti Bam HI-Pst I a lugar ti pBEVY-GL LEU2 a vektor. Ti nagbanagan a plasmid ket napanaganan iti pRGS12. Ti panagsasaruno dagiti oligonukleotido a naus-usar iti daytoy a panagadal ket nailista iti Tabla S2.
Ti kita ket nainayon iti 0.2% nga adenine ken 2% a glukosa [YP-dextrose (YPD)], 2% a raffinose [YP-raffinose] a nabaknang a lebadura a naala a protina p (YP) a medium (1 % Lebadura a naala ken 2% a protina ept). (YPR)] wenno 2% galactose [YP-galactose (YPG)] kas gubuayan ti karbon, wenno iti sintetiko a minimal medium (0.15% yeast nitrogen base ken 0.5% ammonium sulfate) tapno manayonan dagiti maitutop nga amino acids ken bases a kasapulan para iti nutrision , Ken naglaon iti 2% glucose (sintetic glucose minimal medium) wenno 2% galactose (sintetiko a galactose minimal medium) kas gubuayan ti karbon.
Para iti aktual nga oras a panagimahe, dagiti sensitibo iti temperatura a sec31-1 a mutante a selula a mangiyebkas ti konstrukto iti sidong ti GAL1 a promotor ket naimulmula iti YPR a medium iti 24°C iti maysa a rabii aginggana iti tengnga ti log a paset. Kalpasan ti induksionda iti YPG iti 24°C iti 1 nga oras, dagiti selula ket naipatakder iti SG iti 37°C iti 30 a minuto, ken kalpasanna nayakar iti 24°C tapno mairuar manipud iti bloke ti panagibukbok. Nausar ti Concanavalin A a mangikabil kadagiti selula iti sarming a slide ken nailadawan babaen ti SCLIM. Ti SCLIM ket kombinasion ti Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope ken UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), napartak ken nangato a signal-to-noise ratio nga agturong a disc confocal scanner (Yokogawa Electric), kostumbre nga espektrometro, ken kostumbre a panagpalamiis Ti sistema ti image intensifier (Hamamatsu Photonics) ket makaipaay ti sistema ti lente a mangpadakkel nga addaan iti maudi a panagpadakkel iti ×266.7 ken ti charge-coupled device camera a mangpaadu kadagiti elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Ti panagala ti ladawan ket maaramid babaen ti kostumbre a software (Yokogawa Electric). Para kadagiti 3D a ladawan, nagusarkami iti custom-made a piezoelectric actuator tapno agtayyek ti panggep a lente a bertikal, ken inurnongmi dagiti optiko a paset a 100 nm ti naggigiddiatanda iti maysa a bunton. Ti ladawan ti Z-stack ket nabaliwan iti 3D a datos ti voxel, ken ti teoretiko a puntos a panagiwaras a panagandar a naus-usar para iti agturong a disk a konfokal a mikroskopio ket naus-usar para iti panagproseso ti dekonvolusion babaen ti Volocity a software (PerkinElmer). Babaen ti panagusar ti Volocity software tapno automatiko a threshold para iti co-location analysis, narukod ti ERES agraman ti karga. Naaramid ti line scan analysis babaen ti MetaMorph software (Molecular Devices).
Usaren ti GraphPad Prism software tapno maikeddeng ti estadistikal a kaipapanan. Para iti dua-ipus nga Student’s t-test ken ti gagangay a one-way analysis of variance (ANOVA) test, dagiti panagdumaduma iti nagbaetan dagiti grupo ket naibilang nga addaan iti dakkel nga epekto iti P <0.05 (*).
Para iti fluorescence microscopy ti Gas1-GFP, dagiti log phase cells ket naimula iti maysa a rabii iti YPD ken naurnong babaen ti centrifugation, nabugguan iti mamindua babaen ti phosphate buffered saline, ken naipatakder iti yelo iti di kumurang a 15 a minuto, ken kalpasanna naituloy iti sidong ti mikroskopio kas iti dati a nailadawan a Check (24). Ti Leica DMi8 microscope (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) a naikkan iti objective lens, L5 (GFP) filter, Hamamatsu camera ken Application Suite X (LAS X) software ti nausar para iti pannakagun-od. .
Dagiti sample ket na-denature babaen ti SDS sample buffer iti 65°C iti las-ud ti 10 a minuto, ken kalpasanna naisina babaen ti SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Para iti immunoblotting analysis, 10 μl ti sample ti naikarga iti tunggal lane. Kangrunaan nga antibody: Usaren ti rabbit polyclonal anti-Gas1 iti pannakarunaw a 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 iti pannakarunaw a 1:500, ken rabbit polyclonal anti-GFP (sagut manipud ken ni H. Riezman) iti pannakarunaw a 1:3000. Ti mouse monoclonal anti-Pgk1 antibody ket naus-usar iti pannakarunaw iti 1:5000 (maysa a sagut manipud ken ni J. de la Cruz). Segundario nga antibody: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) a nausar iti pannakarunaw iti 1:3000 (Pierce). Nausar ti HRP-conjugated goat anti-mouse IgG iti pannakarunaw iti 1:3000 (Pierce). Ti sona ti sungbat ti immune ket napaliiw babaen ti chemiluminescence a pamay-an ti SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Kas nailadawan iti (31), ti natural nga eksperimento ti immunoprecipitation ket naaramid iti napabaknang nga ER a paset. Iti ababa a pannao, bugguan dagiti selula ti lebadura babaen ti TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ken protease inhibitor mixture) iti 600 nm ( OD600) iti 100 nga optical density iti mamindua. Naburak dayta babaen kadagiti kuentas a sarming, ket kalpasanna naikkat dagiti rugit ti selula ken kuentas ti sarming babaen ti centrifugation. Kalpasanna ti supernatant ket nasentripugo iti 17,000 g iti 15 a minuto iti 4°C. Ti pellet ket nasuspenso manen iti TNE ken ti digitalis saponin ket nainayon iti maudi a konsentrasion a 1%. Ti suspension ket naipatakder iti 1 nga oras nga addaan iti panagrikus iti 4°C, ken kalpasanna dagiti di matunaw a paset ket naikkat babaen ti sentripugo iti 13,000 g iti 4°C iti las-ud ti 60 a minuto. Para iti Gas1-GFP immunoprecipitation, umuna nga i-pre-incubate ti sample babaen ti empty agarose beads (ChromoTek) iti 4°C iti 1 nga oras, ken kalpasanna incubate iti GFP-Trap_A (ChromoTek) iti 4°C iti 3 nga oras. Dagiti immunoprecipitated beads ket nabugguan iti maminlima babaen ti TNE nga addaan iti 0.2% digoxigenin, na-eluted babaen ti SDS sample buffer, naisina iti SDS-PAGE, ken naanalisar babaen ti immunoblotting.
Kas nailadawan iti (31), ti cross-linking determination ket naaramid iti napabaknang nga ER fraction. Iti apagbiit, ti napabaknang nga ER a paset ket naipatakder iti 0.5 mM a dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ti reaksion ti crosslinking ket naiddep babaen ti pananginayon ti glycine (50 mM maudi a konsentrasion, 5 a minuto, 20°C).
Kas iti dati a nailadawan (50), ti MS a panaganalisar ti ceramide kadagiti atap a kita ken GhLag1 a kita ket naaramid. Iti ababa a pannao, dagiti selula ket naipadakkel aginggana iti eksponensial a paset (3 aginggana iti 4 nga OD600 a yunit/ml) iti YPD iti 30°C, ken 25×107 a selula ket naapit. Ti metabolismoda ket maiddep babaen ti trichloroacetic acid. Usaren ti solvent ti panagala [ethanol, danum, eter, piridina ken 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] ken 1.2 nmol ti akin-uneg a pagalagadan a C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) a kalidad). Usaren ti monomethylamine reagent [methanol, danum, n-butanol ken methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] tapno maaramid ti mild alkaline hydrolysis ti extract, ken kalpasanna usaren ti water-saturated n-butanol tapno ma-desalt. Kamaudiananna, ti naala ket nasuspenso manen iti positibo a moda a solvent [chloroform/methanol/danum (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] ken nai-inject iti mass spectrometer. Ti multi-reaction monitoring (MRM) ket naaramid para iti pannakailasin ken panagkuantipika kadagiti molekula ti sphingolipid. Ti TSQ Vantage tersiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) ket addaan iti robotiko a nanoflow nga ion a taudan a Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para iti panaganalisar ti lipido. Ti enerhia ti panagdinnungpar ket nasayaat para iti tunggal maysa a kategoria ti ceramide. Naala ti datos ti MS iti positibo a mode. Para iti tunggal maysa a biolohiko a replikado, ti senial ti lipido ket isu ti median ti tallo nga agwaywayas a rukod.
Kas nailadawan iti (31), dagiti selula (800×107) a mangipakpakita iti Gas1-GFP ket naipasidong iti natural nga immunoprecipitation. Ti nadalus a Gas1-GFP ket naisina babaen ti SDS-PAGE ken nayakar iti polyvinylidene fluoride (PVDF) a membrane. Nailadawan ti protina babaen ti panangmantsa iti PVDF iti amide black. Ti Gas1-GFP band ket naputed manipud iti PVDF ken nabugguan iti 5 a daras babaen ti methanol ken naminsan babaen ti liquid chromatography-MS (LC-MS) grade water. Babaen ti panangipapudot ti membrane strip iti 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer ken 500μl a baro a narunaw a 1 M sodium nitrite mixture iti 37°C iti 3 nga oras, ti lipid fraction ket mairuar manipud iti Gas1-GFP ken lysed Release of inosine phosphate ceramide iti nagbaetan ti glucosamine ken inositol (51). Kalpasan dayta, ti membrane strip ket nabugguan iti uppat a daras babaen ti LC-MS a grado a danum, napagmaga iti temperatura ti siled, ken naidulin iti atmospera ti nitroheno iti -80°C aginggana ti pannakaanalisar. Kas kontrol, nausar ti blangko a sample ti PVDF membrane para iti tunggal eksperimento. Kalpasanna ti lipido a naala manipud iti Gas1-GFP ket naanalisar babaen ti MS a kas nailadawan ( 50 ). Iti ababa a pannao, dagiti PVDF strips a naglaon iti GPI-lipid ket nasuspende manen iti 75μl a negatibo a molde a solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] ken naipasa ti electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Panag-analisar kadagiti kita ti sphingolipid (TSQ Vantage). Iti daytoy a kaso, ti datos ti MS ket naala iti negatibo nga ion a kasasaad.
Kas nadakamat itay, ti lipid a paset ti GPI anchor ket naisina manipud iti [3H]-inositol-labeled a GPI-AP ( 16 ). Dagiti lipido ket naisina babaen ti naingpis-a-suson a kromatograpia babaen ti panagusar ti sistema ti solvent (55:45:10 kloroporma-metanol-0.25% KCl) ken nailadawan babaen ti panagusar ti FLA-7000 (Fujifilm).
Dagiti selula a mangiyebkas ti Gas1-GFP (600×107) ket nabugguan iti mamindua babaen ti TNE buffer nga addaan iti TNE buffer, ken naburak babaen dagiti sarming a kuwintas, ken kalpasanna nasentripugo tapno maikkat dagiti rugit ti selula ken dagiti kuwintas ti sarming. Kalpasanna ti supernatant ket nasentripugo iti 17,000 g iti 1 nga oras iti 4°C. Ti pellet ket nabugguan iti TNE ken naipatakder iti 1 U PI-PLC (Invitrogen) iti TNE a naglaon iti 0.2% digitalis saponin iti 1 nga oras iti 37°C. Kalpasan ti pannakaagas ti enzyme, ti membrane ket naikkat babaen ti centrifugation iti 17,000 g iti 4°C iti las-ud ti 1 nga oras. Tapno immunoprecipitate ti Gas1-GFP, ti supernatant ket naipatakder babaen ti GFP-Trap_A (ChromoTek) iti 4°C iti maysa a rabii. Ti nadalus a Gas1-GFP a naisina babaen ti SDS-PAGE ket namantsaan iti Coomassie brilliant blue. Ti Gas1-GFP a panagmantsa a banda ket naputed manipud iti abuabu a nanglikmut ti aqueduct, ken kalpasanna kalpasan ti alkilasion babaen ti iodoacetamide ken panagpabassit babaen ti dithiothreitol, ti in-gel a panagrunaw babaen ti trypsin ket naaramid. I-extract ken pagpamagaen dagiti tryptic peptides ken peptides nga addaan iti GPI-glycans. Ti namaga a peptide ket narunaw iti 20 μl a danum. I-inject ti maysa a paset (8μl) iti LC. Ti maysa nga octadecylsilane (ODS) nga adigi (Develosil 300ODS-HG-5; akin-uneg a diametro 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prepektura, Hapon) ket naus-usar a mangisina kadagiti peptido iti sidong dagiti espesipiko a kasasaad ti panagrang-ay. Ti mobile phase ket ti solvent A (0.08% pormic acid) ken solvent B (0.15% formic acid iti 80% acetonitrile). Ti maysa nga Accela HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ket naus-usar a mang-elute ti adigi babaen ti solvent A iti uneg ti 55 a minuto iti panagayus a rate a 50 μl min-1 iti las-ud ti 5 a minuto, ken kalpasanna ti konsentrasion ti solvent B ket naingato iti 40%. , Estados Unidos). Ti eluate ket agtultuloy a naiyam-ammo iti taudan ti ion ti ESI, ken dagiti tryptiko a peptido ken peptido nga addaan iti GPI-glycan ket naanalisado babaen ti LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Iti MS a panagisaad, ti boltahe ti taudan ti kapilaria ket naikeddeng iti 4.5 kV, ken ti temperatura ti panagiyakar a kapilaria ket natengngel iti 300°C. Ti boltahe ti kapilaria ken boltahe ti lente ti tubo ket naikeddeng iti 15 V ken 50 V, agpada. Ti datos ti MS ket naala iti positibo nga ion a wagas (resolusion iti 60,000; ti kinaumiso ti masa iti 10 a paset iti tunggal maysa a milion) iti sakop ti masa iti 300/m/z a masa/karga a ratio (m/z) 3000. Ti datos ti MS/MS ket naala babaen ti ion a silo iti LTQ Orbitrap XL [ti umuna a 3 a digito a ti datos ket agpannuray, ti panagdinnungpar a naiduron a panagsisina (CID)].
Dagiti MD a panagsimula ket naaramid babaen ti panagusar ti GROMACS (52) a software ken MARTINI 2 a tay-ak ti puersa (53-55). Kalpasanna ti CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ket naus-usar a mangbangon ti bilayer a naglaon ti dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) ken Cer C18 wenno DOPC ken Cer C26. Ti topolohia ken dagiti koordinado ti Cer C26 ket nagtaud manipud iti DXCE babaen ti panangikkat kadagiti ekstra a kuwintas manipud iti ipus ti sphingosine. Usaren ti proseso a nailadawan iti baba tapno agbalanse ti doble a sapasap ken mapataray daytoy, kalpasanna usaren dagiti maudi a koordinado ti sistema tapno mangbangon ti sistema a naglaon ti Emp24. Ti transmembrane a dominio ti lebadura nga Emp24 (dagiti nabati 173 aginggana iti 193) ket naibangon a kas maysa nga α-helix babaen ti panagusar ti biswal nga MD (VMD) a ramit a molekular nga estruktura ( 58 ). Kalpasanna, kalpasan ti pannakaikkat dagiti agsasabtan a lipido, ti protina ket nalukneng a nagranula ken naikabil iti bilayer babaen ti panagusar ti CHARMM GUI. Ti maudi a sistema ket naglaon ti 1202 a DOPC ken 302 Cer C26 wenno 1197 a DOPC ken 295 Cer C18 ken Emp24. Ionize ti sistema iti konsentrasion a 0.150M. Uppat nga agwaywayas a replikado ti naaramid para iti dua a bilayer a komposision.
Ti lipid bilayer ket natimbeng babaen ti panagusar ti proseso ti CHARMM GUI, a mairaman ti panangkissay ken kalpasanna ti panangtimbeng kadagiti 405,000 nga addang, a sadiay dagiti limitasion ti posision ket in-inut a makissayan ken maikkat, ken ti addang ti oras ket naingato manipud iti 0.005 ps aginggana iti 0.02 ps. Kalpasan ti panagtimbeng, daytoy ket mangpataud ti 6 μs nga addaan iti addang ti panawen iti 0.02 ps. Kalpasan ti panangikabil ti Emp24, usaren ti isu met laeng a proseso ti CHARMM GUI tapno mapabassit ken mabalanse ti sistema, ken kalpasanna agtaray iti 8 s iti produksion.
Para kadagiti amin a sistema, bayat ti proseso ti panagtimbeng, ti presion ket kontrolado babaen ti barostat ti Berendsen (59), ken bayat ti proseso ti panagpataud, ti presion ket kontrolado babaen ti barostat ti Parrinello-Rahman (60). Iti amin a kaso, ti promedio a presion ket 1 bar ken ti semi-isotropiko nga eskema ti panagikapet ti presion ket naus-usar. Iti proseso ti panagtimbeng ken panagpataud, ti termostat (61) nga addaan iti kapartak a panagkalibrasion manen ket maus-usar a mangikapet ti temperatura ti protina, lipido ken dagiti partikulo ti solvent a nagsasaruno. Bayat ti intero nga operasion, ti target temperature ket 310K. Ti saan a panagsilpo a panagtitinnulong ket nakuenta babaen ti panagpataud ti listaan ​​ti panagparis babaen ti panagusar ti eskema ti Verlet nga addaan iti 0.005 a panaganus ti buffer. Ti termino ti Coulomb ket nakuenta babaen ti panagusar ti tay-ak ti reaksion ken ti naputed a distansia iti 1.1 nm. Ti termino ti Vander Waals ket agus-usar ti eskema ti pannakaputed nga addaan iti distansia ti pannakaputed iti 1.1 nm, ken ti eskema ti pannakaputed ti Verlet ket naus-usar para iti potensial a panaganud (62).
Babaen ti panagusar ti VMD, ti cutoff wavelength iti nagbaetan dagiti DOPC phosphate beads wenno ceramide AM1 beads ken ti protina ket 0.7 nm, ken ti bilang dagiti lipido a makilanglangen iti protina ket nakuenta. Segun iti sumaganad a pormula, kalkularen ti depletion-enrichment (DE) factor kas iti (63): DE factor = (ti kaadu ti dagup a lipido iti protina 0.7) iti protina 0.7 (ti kaadu ti Cer iti dagup a lipido) .
Ti naipadamag a pateg ket nagun-od a kas ti promedio, ken dagiti bara ti biddut ket uppat nga agwaywayas a kopia ti SE. Ti estadistikal a kaipapanan ti DE factor ket nakuenta babaen ti t test [(promedioDE-factor-1)/SE]. Karkuloen ti pateg ti P manipud iti maysa-ti-ipus a pannakaiwaras.
Ti ramit ti GROMACS ket naus-usar a mangkuenta ti 2D a mapa ti lateral a densidad ti sistema a naglaon ti Emp24 iti uneg ti maudi a 250 ns ti pagsurotan. Tapno magun-od ti mapa ti panagpabaknang/panagkissay ti ceramide, ti mapa ti densidad ti Cer ket mabingbingay babaen ti kaaduan ti mapa ti Cer ken DOPC, ken kalpasanna mabingbingay babaen ti konsentrasion ti Cer iti bagi. Ti isu met laeng a sukog ti mapa ti kolor ti mausar.
Para kadagiti suplementario a materiales para iti daytoy nga artikulo, pangngaasi a kitaen ti http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Daytoy ket maysa nga artikulo ti silulukat a panagserrek a naiwarwaras babaen dagiti kondision ti Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, a mangipalubos ti panagusar, panagiwaras ken panagpaadu iti ania man a medium, no la ketdi ti maudi a panagusar ket saan a para iti komersial a gunggona ken ti premisa ket ti orihinal nga obra ket umiso. Reperensia.
Pakaammo: Kiddawenmi laeng nga itedmo ti email address-mo tapno ammo ti tao nga irekomendarmo iti panid a kayatmo a makitada ti email ken saan nga spam dayta. Saanmi a matiliw ti aniaman nga email address.
Daytoy a saludsod ket mausar a mangsubok no maysaka a bisita ken manglapped iti automatiko a panagipatulod ti spam.
Sofia Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Pérez -Linero), Sergio López (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ti 3D a nangato a resolusion nga aktual nga oras a panagimahe ket mangipalgak ti kinapateg ti kaatiddog ​​ti kadena ti ceramide para iti panagurnos ti protina kadagiti mapili a lugar ti panagruar.
Sofia Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Pérez -Linero), Sergio López (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ti 3D a nangato a resolusion nga aktual nga oras a panagimahe ket mangipalgak ti kinapateg ti kaatiddog ​​ti kadena ti ceramide para iti panagurnos ti protina kadagiti mapili a lugar ti panagruar.
©2020 Kappon ti Amerikano para iti Panagrang-ay ti Siensia. amin a karbengan ket naisagana. Ti AAAS ket kasosio ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ken COUNTER. Dagiti Panagrang-ay ti Siensia ISSN 2375-2548.