Ti artikulo ket paset ti topiko ti panagsukisok a “Panangpasayaat ti resistensia dagiti legumes kadagiti patoheno ken peste”, kitaen amin a 5 nga artikulo
Ti makagapu nga ahente ti fungal plant disease necrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ket agus-usar ti adu a tukad nga estratehia tapno maimpektaran dagiti nadumaduma a mangsangaili a mula. Daytoy a panagadal ket mangisingasing ti panagusar ti diamine L-ornithine, ti saan a protina nga amino asido a mangtignay ti sintesis dagiti dadduma pay a nasken nga amino asido, a kas maysa nga alternatibo nga estratehia ti panagmanehar tapno mapasayaat dagiti molekular, pisiolohiko ken biokemikal a sungbat ti Phaseolus vulgaris L. iti puraw nga amag a gapuanan ti Pseudomonas sclerotiorum. Dagiti eksperimento iti in vitro ket nangipakita a ti L-ornithine ket nangruna a nanglapped ti mycelial a panagdakkel ti S. pyrenoidosa iti dosis-a-nagdepende a wagas. Maysa pay, mabalin a dakkel ti maitulongna a mangkissay iti kinakaro ti puraw nga amag iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse. Maysa pay, ti L-ornithine ti nangtignay iti panagdakkel dagiti naagasan a mula, a mangipakpakita a dagiti nasubok a konsentrasion ti L-ornithine ket saan a phytotoxic kadagiti naagasan a mula. Mainayon pay, ti L-ornithine ket nangparang-ay ti panagiyebkas kadagiti saan nga ensimatiko nga antioksidante (dagup a matunaw a phenolics ken flavonoids) ken dagiti ensimatiko nga antioksidante (catalase (CAT), peroxidase (POX), ken polyphenol oxidase (PPO)), ken nangipangato ti panagiyebkas ti tallo a mainaig iti antioksidante a gene (PvCAT1, PvSOD, ken PvGR). Iti pay maipatinayon, ti in silico a panaganalisar ket nangipalgak ti kaadda ti maipagarup nga oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) a protina iti S. sclerotiorum a genome, a daytoy ket kapada unay kadagiti oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) a protina ti Aspergillus fijiensis (AfOAH) ken Penicillium sp. (PlOAH) kadagiti termino ti panagandar a panaganalisar, dagiti napreserba a dominio, ken topolohia. Makapainteres, ti pannakainayon ti L-ornithine iti potato dextrose broth (PDB) medium ket nangruna a nangkissay iti panagiyebkas ti SsOAH gene iti S. sclerotiorum mycelia. Kasta met, ti exogenous application ti L-ornithine ket nangruna a nangkissay ti panagiyebkas ti SsOAH gene kadagiti fungal mycelia a naurnong manipud kadagiti naagasan a mula. Kamaudiananna, ti panangipakat iti L-ornithine ket dakkel a nangkissay iti panagruar ti oxalic acid agpadpada kadagiti PDB medium ken naimpektaran a bulong. Iti konklusion, ti L-ornithine ket addaan iti kangrunaan nga akem iti panangtaginayon ti kasasaad ti redox ken kasta met a mangpasayaat ti sungbat ti depensa dagiti naimpektaran a mula. Mabalin a makatulong dagiti resulta daytoy a panagadal iti panangpataud kadagiti makabaro, makaay-ayo iti aglawlaw a pamay-an tapno makontrol ti puraw nga amag ken mapabassit ti epektona iti panagpataud iti saba ken dadduma pay nga apit.
Ti puraw nga amag, a gapuanan ti nekrotropiko a fungus a Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ket maysa a makadadael, mangkissay iti apit a sakit a mangpataud iti nakaro a pangta iti sangalubongan a panagpataud ti saba (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Ti Sclerotinia sclerotiorum ket maysa kadagiti karirigatan a makontrol a patoheno ti mula a fungus nga iyakar ti daga, nga addaan iti nalawa a sakop ti mangsangaili iti nasurok nga 600 a sebbangan ti mula ken ti abilidad a napardas a mangmacerate kadagiti tisyu ti mangsangaili iti saan nga espesipiko a wagas (Liang ken Rollins, 2018). Iti sidong dagiti saan a paborable a kasasaad, daytoy ket agpasar iti kritikal a paset ti siklo ti biagna, nga agtalinaed a nakaturog iti napaut a panawen a kas dagiti nangisit, natangken, kasla bukel nga estruktura a tinawtawagan iti 'sclerotia' iti daga wenno kas dagiti puraw, nalamuyot a panagtubo iti mycelium wenno stem pith dagiti naimpektaran a mula (Schwartz et al., 2005). Ti S. sclerotiorum ket makabael a mangporma ti sclerotia, a mangipalubos daytoy nga agbiag kadagiti naimpektaran a talon iti napaut a panawen ken agtalinaed bayat ti sakit (Schwartz et al., 2005). Dagiti esklerotia ket nabaknang kadagiti sustansia, mabalin nga agtalinaed iti daga iti napaut a panawen, ken agserbi a kas ti kangrunaan nga inokulo para kadagiti sumaganad nga impeksion (Schwartz et al., 2005). Iti sidong dagiti paborable a kasasaad, dagiti esklerotia ket agtubo ken mangpataud kadagiti espora nga adda iti angin a mabalin a mangapektar kadagiti amin a paset ti mula iti ngato ti daga, a mairaman ngem saan a limitado kadagiti sabong, puon, wenno dagiti bukel (Schwartz et al., 2005).
Ti Sclerotinia sclerotiorum ket agus-usar ti adu a tukad nga estratehia tapno maimpektaran dagiti mangsangaili a mulana, a mairaman ti agsasaruno a naurnos a pasamak manipud iti panagtubo ti sclerotial aginggana iti panagrang-ay ti sintoma. Iti damo, ti S. sclerotiorum ket mangpataud kadagiti naibitin nga espora (maawagan iti ascospores) manipud kadagiti kasla uong nga estruktura a tinawtawagan iti apothecia, nga agbalin nga airborne ken dumakkel a saan a motile sclerotia kadagiti naimpektaran a rugit ti mula (Bolton et al., 2006). Kalpasanna ti fungus ket mangiruar ti oxalic acid, ti maysa a birulensi a banag, tapno makontrol ti pH ti diding ti selula ti mula, mangitandudo ti ensimatiko a panagdadael ken panagraut ti tisyu ( Hegedus ken Rimmer, 2005 ), ken manglapped ti oksidatibo a panagburak ti mangsangaili a mula. Daytoy a proseso ti panagasido ket mangpakapuy ti diding ti selula ti mula, a mangipaay ti paborable nga aglawlaw para iti normal ken episiente a panagpataray dagiti fungal cell wall degrading enzymes (CWDEs), a mangipalubos ti patoheno a mangparmek ti pisikal a bangen ken sumrek kadagiti tisyu ti mangsangaili (Marciano et al., 1983). Apaman a makastrek, ti ​​S. sclerotiorum ket mangiruar kadagiti sumagmamano a CWDE, a kas ti polygalacturonase ken cellulase, a mangpasayaat ti pannakaiwarasna kadagiti naimpektaran a tisyu ken mangpataud ti tissue necrosis. Ti panagrang-ay dagiti sugat ken dagiti hyphal mat ket mangiturong kadagiti naisangayan a sintoma ti puraw nga amag (Hegedus ken Rimmer, 2005). Kabayatanna, dagiti mangsangaili a mula ket makabigbigda kadagiti patoheno-a nainaig a molekular a padron (PAMP) babaen dagiti padron a pannakabigbig a reseptor (PRR), a mangtignay kadagiti serye dagiti pasamak ti panagsenyas a kamaudiananna ket mangpaaktibo kadagiti sungbat ti depensa.
Iti laksid ti pinulpullo a tawen a panagregget a mangkontrol iti sakit, agtalinaed ti kinakurang ti umdas a naandur a germplasm iti bean, kas kadagiti dadduma a komersial nga apit, gapu iti resistensia, panagbiag, ken pannakibagay ti patoheno. Ti panagaywan ti sakit ket ngarud nalabes a makakarit ken agkasapulan ti naikaykaysa, adu a paset nga estratehia a mairaman ti kombinasion dagiti kultural nga aramid, biolohiko a panagtengngel, ken dagiti kemikal a fungicides (O'Sullivan et al., 2021). Ti kemikal a panangkontrol iti puraw nga amag ti kaepektibuan gapu ta dagiti fungicides, no umiso ken umiso ti pannakaipakatda, epektibo a makontrol ti panagwaras ti sakit, pabassitenda ti kinakaro ti impeksion, ken mangkissay iti pannakapukaw ti apit. Nupay kasta, ti nalabes a panagusar ken nalabes a panagpannuray kadagiti fungicides ket mabalin a mangiturong iti panagruar dagiti naandur a kita ti S. sclerotiorum ken negatibo ti epektona kadagiti saan a target nga organismo, salun-at ti daga, ken kalidad ti danum ( Le Cointe et al., 2016 ; Ceresini et al., 2024 ). Gapuna, nagbalinen a kangrunaan a prioridad ti panangbirok kadagiti alternatibo a makaay-ayo iti aglawlaw.
Dagiti polyamines (PAs), a kas ti putrescine, spermidine, spermine, ken cadaverine, ket mabalin nga agserbi a kas dagiti nainkari nga alternatibo a maibusor kadagiti patoheno ti mula nga iyakar ti daga, iti kasta naan-anay wenno paset a mangkissay ti panagusar kadagiti napeggad a kemikal a fungicides (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Kadagiti nangatngato a mula, dagiti PA ket mairaman kadagiti adu a pisiolohiko a proseso a mairaman, ngem saan a limitado iti, panagbingbingay ti selula, panaglalasin, ken sungbat kadagiti abiotiko ken biotiko a panagbannog (Killiny ken Nehela, 2020). Dagitoy ket mabalin nga agtignay a kas dagiti antioksidante, makatulong a mang-scavenge kadagiti reaktibo nga oksihena a sebbangan (ROS), mangmantener ti redox homeostasis ( Nehela ken Killiny, 2023), mangtignay kadagiti gene a mainaig iti depensa ( Romero et al., 2018 ), mangregula kadagiti nadumaduma a metaboliko a dalan ( Nehela ken Killiny, 2023 ), mangmodula kadagiti endoheno a phytohormone (Nehela ken Killiny, 2023 ) . 2019), mangipatakder ti sistematiko a nagun-od a resistensia (SAR), ken mangregula kadagiti panagtitinnulong ti mula-patoheno ( Nehela ken Killiny, 2020 ; Asija et al., 2022 ; Czerwoniec, 2022 ). Maipalagip a dagiti espesipiko a mekanismo ken akem dagiti PA iti depensa ti mula ket agdumaduma depende kadagiti kita ti mula, dagiti patoheno, ken dagiti kasasaad ti aglawlaw. Ti kaaduan a PA kadagiti mula ket biosintesis manipud iti nasken a polyamine L-ornithine (Killiny ken Nehela, 2020).
Adu ti akem ti L-ornithine iti panagdakkel ken panagdakkel ti mula. Kas pagarigan, dagiti napalabas a panagadal ket nangipakita nga iti pagay (Oryza sativa), ti ornithine ket mabalin a nainaig iti panag-recycle ti nitroheno (Liu et al., 2018), apit ti pagay, kalidad ken ayamuom (Lu et al., 2020), ken sungbat ti stress ti danum (Yang et al., 2000). Maysa pay, ti exogenous a panagusar ti L-ornithine ket nangruna a nangparang-ay ti panaganus ti tikag iti sugar beet (Beta vulgaris) ( Hussein et al., 2019 ) ken nangpabassit ti panagbannog ti asin iti sibuyas (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ken Çavuşoǧlu, 2021) ken cashew (Anacardium occidentale) . dagiti mula (da Rocha et al., 2012). Ti potensial nga akem ti L-ornithine iti abiotiko a depensa ti stress ket mabalin a gapu ti pannakairamanna iti panagurnong ti prolina kadagiti naagasan a mula. Kas pagarigan, dagiti gene a mainaig iti metabolismo ti prolina, a kas dagiti gene ti ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) ken proline dehydrogenase (ProDH1 ken ProDH2), ket dati a naipadamag a mairaman iti depensa ti Nicotiana benthamiana ken Arabidopsis thaliana kadagiti saan a mangsangaili a kita ti Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar ken Mysore, 2012) nga . Iti sabali a bangir, ti fungal ornithine decarboxylase (ODC) ket kasapulan para iti panagdakkel ti patoheno (Singh et al., 2020). Panangpuntiria iti ODC ti Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici babaen ti host-induced gene silencing (HIGS) ket nangruna a nangparang-ay ti panagandur dagiti mula ti kamatis iti Fusarium wilt (Singh et al., 2020). Nupay kasta, ti potensial nga akem ti exoheno nga ornithine nga aplikasion a maibusor kadagiti biotiko a panagbannog a kas dagiti phytopathogens ket saan pay a nasayaat a naadal. Napatpateg pay, dagiti epekto ti ornithine iti panagandur iti sakit ken dagiti nainaig a biokemikal ken pisiolohikal a penomenon ket agtaltalinaed a kaaduan a saan a nasuksukisok.
Ti pannakaawat ti kinarikut ti impeksion ti S. sclerotiorum kadagiti legumes ket napateg para iti pannakapataud dagiti epektibo nga estratehia ti panangtengngel. Iti daytoy a panagadal, pinanggepmi a mailasin ti potensial nga akem ti diamine L-ornithine kas kangrunaan a banag iti panangpasayaat kadagiti mekanismo ti depensa ken resistensia dagiti mula a legume iti impeksion ti Sclerotinia sclerotiorum. Ipagarupmi a, malaksid iti panangpasayaat kadagiti sungbat ti depensa dagiti naimpektaran a mula, ti L-ornithine ket addaan pay iti kangrunaan nga akem iti panangtaginayon ti kasasaad ti redox. Isingasingmi a dagiti potensial nga epekto ti L-ornithine ket mainaig iti regulasion dagiti enzymatic ken non-enzymatic antioxidant defense mechanisms ken pannakasinga kadagiti fungal pathogenicity/virulence factors ken dagiti nainaig a protina. Daytoy a doble a panagandar ti L-ornithine ti mamagbalin iti daytoy a nainkari a kandidato para iti natalged nga estratehia a mangpabassit iti epekto ti puraw nga amag ken mangpasayaat iti resistensia dagiti gagangay nga apit ti legume iti daytoy napigsa a fungal pathogen. Mabalin a makatulong dagiti resulta ti agdama a panagadal iti pannakapataud dagiti makabaro, makaay-ayo iti aglawlaw a pamay-an tapno makontrol ti puraw nga amag ken mapabassit ti epektona iti panagpataud iti legume.
Iti daytoy a panagadal, ti nalaka a maakaran a komersial a barayti ti gagangay a saba, ti Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ket nausar a kas eksperimental a material. Dagiti nasalun-at a bukel ket siaasi nga impaay ti Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypt. Lima a bukel ti naimula kadagiti plastik a kaldero (akin-uneg a diametro 35 cm, kauneg 50 cm) a napno iti daga a naimpektaran iti S. sclerotiorum iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse (25 ± 2 °C, relatibo a dam-eg 75 ± 1%, 8 h lawag/16 h nasipnget). Iti 7–10 nga aldaw kalpasan ti panagmula (DPS), naingpis dagiti semilia tapno maibati laeng ti dua a semilia nga agpapada ti panagdakkelda ken tallo a naan-anay a napalawa a bulong iti tunggal kaldero. Amin a mula a naikabil iti kaldero ket nasibugan iti maminsan iti kada dua a lawas ken naabono iti binulan iti mairekomendar a rate para iti naited a barayti.
Tapno maisagana ti 500 mg/L a konsentrasion ti L-ornithinediamine (ammo pay a kas (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), ti 50 mg ket immuna a narunaw iti 100 mL nga esterilisado a nadistilo a danum. Kalpasanna, nabartek ti stock solution ken nausar kadagiti simmaruno nga eksperimento. Iti apagbiit, innem a serye ti konsentrasion ti L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100, ken 125 mg/L) ti nasubok iti in vitro. Mainayon pay, nausar ti sterile distilled water kas negatibo a kontrol (Mock) ken nausar a positibo a kontrol ti komersial a fungicide a “Rizolex-T” 50% wettable powder (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt). Nasubok ti komersial a fungicide a “Rizolex-T” iti in vitro iti lima a konsentrasion (2, 4, 6, 8 ken 10 mg/L).
Dagiti sample ti gagangay a puon ti beans ken pods a mangipakpakita kadagiti gagangay a sintoma ti puraw nga amag (infestation rate: 10–30%) ket naurnong manipud kadagiti komersial a talon. Urayno kaaduan kadagiti naimpektaran a materiales ti mula ket nailasin babaen dagiti sebbangan/barayti (nalaka a maakaran a komersial a barayti Giza 3), dagiti dadduma, nangruna dagitoy a naala manipud kadagiti lokal a merkado, ket saan nga ammo a kita. Dagiti naurnong a naimpektaran a materiales ket immuna a nadisinpekta iti rabaw babaen ti 0.5% a sodium hypochlorite solution iti 3 a minuto, kalpasanna nabugguan iti sumagmamano a daras babaen ti esterilisado a nadistilo a danum ken napunas a namaga babaen ti esterilisado a filter paper tapno maikkat ti sobra a danum. Kalpasanna dagiti naimpektaran nga organo ket naputed kadagiti babassit a pedaso manipud iti tengnga a tisyu (iti nagbaetan dagiti nasalun-at ken naimpektaran a tisyu), nakultura iti patatas a dextrose agar (PDA) a medium ken naipatakder iti 25 ± 2 °C nga addaan iti 12 h a siklo ti lawag/12 h a nasipnget iti las-ud ti 5 nga aldaw tapno mangtignay ti panagporma ti sclerotia. Nausar met ti pamay-an ti mycelial tip a mangdalus kadagiti naibukod a fungal manipud kadagiti naglaok wenno kontaminado a kultura. Ti nadalus a naibukod a fungus ket immuna a nailasin a naibatay kadagiti kultural a morpolohiko a pakabigbiganna ken kalpasanna ket napasingkedan a kas ti S. sclerotiorum a naibatay kadagiti mikroskopiko a tampok. Kamaudiananna, amin a nadalus a naibukod ket nasubok para iti patogenisida iti nalaka a maakaran a gagangay a kultibar ti saba a Giza 3 tapno makasangpet kadagiti postulato ni Koch.
Iti pay maipatinayon, ti kaaduan a makaraut nga S. sclerotiorum a naibukod (isolate #3) ket ad-adda pay a napasingkedan a naibatay iti akin-uneg a naisurat nga espasador (ITS) a panagsasaruno a kas inladawan babaen ni White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Iti apagbiit, dagiti naibukod ket nakultura iti saba ti patatas a dextrose (PDB) ken naipatakder iti 25 ± 2 °C iti las-ud ti 5–7 nga aldaw. Kalpasanna, naurnong ti fungal mycelium, nasala babaen ti cheesecloth, nabugguan iti mamindua iti esterilisado a danum, ken namaga babaen ti sterile filter paper. Ti genomiko a DNA ket naisina babaen ti panagusar ti Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Kalpasanna ti rehion ti ITS rDNA ket naamplifikar babaen ti panagusar ti espesipiko a paris ti primer ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; manamnama a kadakkel: 540 bp) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Dagiti nadalus a produkto ti PCR ket naisubmitir para iti panagsasaruno (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Dagiti panagsasaruno ti ITS rDNA ket naurnos a bidireksional babaen ti panagusar ti pamay-an ti panagsasaruno ti Sanger. Kalpasanna dagiti naurnong a panagsasaruno ti panagsaludsod ket naipadpada kadagiti kaudian a datos iti GenBank ken ti Nailian a Sentro para iti Impormasion ti Bioteknolohia (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) babaen ti panagusar ti software ti BLASTn. Ti panagsasaruno ti panagsaludsod ket naipadpada kadagiti 20 a dadduma pay a kita/naisina ti S. sclerotiorum a naala manipud kadagiti kaudian a datos iti NCBI GenBank (Supplementary Table S1) babaen ti panagusar ti ClustalW iti Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; bersion 11) (Kumar et al., 2024). Ti ebolusionario a panaganalisar ket naaramid babaen ti panagusar ti maximum likelihood a pamay-an ken ti sapasap a panawen-a-mabaliwan a modelo ti panagsukat ti nukleotido ( Nei ken Kumar, 2000 ). Ti kayo nga addaan iti kangatuan a log-likelihood ket naipakita. Ti rugi a kayo para iti heuristiko a panagbiruk ket napili babaen ti panagpili ti kayo nga addaan iti nangatngato a log-likelihood iti nagbaetan ti kaarruba-a-mangtipon (NJ) a kayo (Kumar et al., 2024) ken ti kayo ti kangatuan a parsimonia (MP). Ti kayo ti NJ ket naibangon babaen ti panagusar ti agparis a matris ti distansia a nakuenta babaen ti panagusar ti sapasap a modelo ti panawen-mabaliwan (Nei ken Kumar, 2000).
Ti antibacterial activity ti L-ornithine ken ti bactericide a “Rizolex-T” ket naikeddeng iti in vitro babaen ti agar diffusion method. Pamay-an: Mangala ti maitutop a kaadu ti stock solution ti L-ornithine (500 mg/L) ken ilaok a naimbag iti 10 ml ti PDA nutrient medium tapno maisagana dagiti solusion nga addaan iti maudi a konsentrasion a 12.5, 25, 50, 75, 100 ken 125 mg/L, agpada. Lima a konsentrasion ti fungicide a “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 ken 10 mg/L) ken sterile distilled water ti nausar kas kontrol. Kalpasan a ti medium ket natangken, ti baro a naisagana a mycelial plug ti kultura ti Sclerotinia sclerotiorum, 4 mm ti diametrona, ket nayakar iti tengnga ti Petri dish ken nakultura iti 25±2°C aginggana a ti mycelium ket sinakupna ti sibubukel a kontrol a Petri dish, kalpasan daytoy ti panagdakkel ti fungus ket nairekord. Karkuloen ti porsiento a pananglapped ti radial a panagdakkel ti S. sclerotiorum babaen ti panagusar ti ekuasion 1:
Namindua a naulit ti eksperimento, nga addaan iti innem a biolohikal a replika para iti tunggal kontrol/eksperimental a grupo ken lima a kaldero (dua a mula iti tunggal kaldero) para iti tunggal biolohikal a replika. Tunggal biolohikal a replika ket namindua a naanalisar (dua a teknikal a replika) tapno masigurado ti kinaumiso, kinamapagtalkan ken pannakapaadu dagiti resulta ti eksperimento. Iti pay maipatinayon, ti panaganalisar ti panagsubli ti probit ket naus-usar a mangkuenta ti kagudua-a-maximal a manglapped a konsentrasion (IC50) ken IC99 (Prentice, 1976).
Tapno matingiting ti potensial ti L-ornithine iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse, dua nga agsasaruno nga eksperimento iti kaldero ti naaramid. Iti apagbiit, dagiti kaldero ket napno iti na-sterilize a damili-darat a daga (3:1) ken nabakunaan iti baro a naisagana a kultura ti S. sclerotiorum. Umuna, ti kaaduan a makaraut nga isolate ti S. sclerotiorum (isolate #3) ket nakultura babaen ti panangputed iti maysa nga sclerotium iti kagudua, panangikabil iti daytoy a nakasango iti baba iti maysa a PDA ken panangipapudot iti 25°C iti kanayon a sipnget (24 h) iti 4 nga aldaw tapno mangtignay iti panagdakkel ti mycelial. Kalpasanna, uppat a 5 mm ti diametro nga agar plugs ti naala manipud iti mangiturong nga igid ken na-inokulado iti 100 g ti sterile mixture ti trigo ken rice bran (1:1, v/v) ken amin a prasko ket naipatakder iti 25 ± 2 °C iti sidong ti 12 h light/12 h nasipnget a siklo iti 5 nga aldaw tapno matignay ti panagporma ti sclerotia. Nalaokan a naimbag ti linaon ti amin a prasko tapno masigurado ti homogeneity sakbay a mainayon ti daga. Kalpasanna, 100 g ti kolonizing bran mixture ti nainayon iti tunggal kaldero tapno masigurado ti kanayon a konsentrasion dagiti pathogens. Nasibugan dagiti nabakunaan a kaldero tapno mapaaktibo ti panagdakkel ti fungus ken naikabil iti greenhouse conditions iti 7 nga aldaw.
Kalpasanna, naimula ti lima a bukel ti barayti ti Giza 3 iti tunggal banga. Para kadagiti kaldero a naagasan iti L-ornithine ken ti fungicide a Rizolex-T, dagiti na-sterilize a bukel ket umuna a nabasa iti dua nga oras iti nadalusan a solusion ti dua a compound nga addaan iti maudi a konsentrasion ti IC99 nga agarup 250 mg/L ken 50 mg/L, agpada, ken kalpasanna napagmaga iti angin iti maysa nga oras sakbay ti panagmula. Iti sabali a bangir, nabasa dagiti bukel iti sterile distilled water kas negatibo a kontrol. Kalpasan ti 10 nga aldaw, sakbay ti umuna a panagsibug, naingpis dagiti semilia, a nabati laeng ti dua a nadalus a semilia iti tunggal kaldero. Mainayon pay, tapno masigurado ti impeksion iti S. sclerotiorum, dagiti puon ti mula a saba iti isu met laeng a tukad ti panagdur-as (10 nga aldaw) ket naputed iti dua a nagduduma a lokasion babaen ti panagusar ti sterilized scalpel ken agarup a 0.5 g ti kolonizing bran mixture ket naikabil iti tunggal sugat, a sinaruno ti nangato a dam-eg tapno mangtignay ti impeksion ken panagrang-ay ti sakit kadagiti amin a nai-inokulado a mula. Dagiti mula a kontrol ket umasping a nasugatan ken ti agpapada a kaadu (0.5 g) ti esterilisado, saan a nakolonia a naglaok a bran ket naikabil iti sugat ken natengngel iti sidong ti nangato a dam-eg tapno matulad ti aglawlaw para iti panagrang-ay ti sakit ken masigurado ti panagpapada iti nagbaetan dagiti grupo ti panangagas.
Pamay-an ti panangagas: Nasibugan dagiti semilia ti saba iti 500 ml a nadalusan a solusion ti L-ornithine (250 mg/l) wenno ti fungicide a Rizolex-T (50 mg/l) babaen ti panangpadanum iti daga, kalpasanna naulit ti panangagas iti mamitlo iti nagbaetan ti 10 nga aldaw. Dagiti kontrol a naagasan iti placebo ket napadanuman iti 500 ml nga esterilisado a nadistilo a danum. Amin a panagagas ket naaramid babaen dagiti kasasaad ti greenhouse (25 ± 2°C, 75 ± 1% a relatibo a dam-eg, ken ti photoperiod ti 8 h a lawag/16 h a nasipnget). Amin a kaldero ket nasibugan iti dua a lawas ken naagasan iti binulan babaen ti natimbeng nga abono nga NPK (20-20-20, nga addaan iti 3.6% nga asupre ken TE microelements; Zain Seeds, Egypt) iti konsentrasion a 3–4 g/l babaen ti foliar spraying segun kadagiti rekomendasion para iti espesipiko a barayti ken instruksion ti agpatpataud. Malaksid no naibaga ti sabali, dagiti naan-anay a napalawa a nataengan a bulong (maika-2 ken maika-3 a bulong manipud iti ngato) ket naurnong manipud iti tunggal maysa a biolohiko a replika iti 72 h kalpasan ti pannakaagas (hpt), na-homogenized, naurnong ken naidulin iti -80 °C para kadagiti kanayonan nga analisar a mairaman, ngem saan a limitado iti, in situkemika a lokalisasion dagiti oksidatibo a stress indicators, lipid peroxidation, enzymatic ken non-enzymatic antioxidants ken gene expression.
Ti kapigsa ti impeksion ti puraw nga amag ket natakderan iti linawas a 21 nga aldaw kalpasan ti inokulasion (dpi) babaen ti panagusar ti sukog ti 1–9 (Supplementario a Tabla S2) a naibatay iti Petzoldt ken Dickson a sukog (1996) a nabaliwan babaen ni Teran et al. (2006) nga . Iti apagbiit, nasukimaten dagiti puon ken sanga dagiti mula a saba a nangrugi iti punto ti pannakabakuna tapno masurot ti panagrang-ay dagiti sugat iti igid dagiti internode ken node. Kalpasanna narukod ti kaadayo ti sugat manipud iti punto ti inokulasion agingga iti kaadaywan a punto iti igid ti puon wenno sanga ken naituding ti puntos a 1–9 a naibatay iti lokasion ti sugat, a sadiay ti (1) ket nangipamatmat nga awan ti makita nga impeksion iti asideg ti punto ti inokulasion ken (2–9) ket nangipamatmat ti in-inut a panagadu ti kadakkel ti sugat ken panagrang-ay iti igid dagiti nodo/internode (Supplementary Table S2). Kalpasanna, nabaliwan ti kapigsa ti impeksion ti puraw nga amag iti porsiento babaen ti panangusar iti pormula 2:
Iti pay maipatinayon, ti kalawa iti baba ti kurba ti panagrang-ay ti sakit (AUDPC) ket nakuenta babaen ti panagusar ti pormula ( Shaner ken Finney, 1977 ), a nabiit pay a naibagay para iti puraw a panagrunot ti gagangay a saba (Chauhan et al., 2020) babaen ti panagusar ti ekuasion 3:
Saan a ti Yi = kinakaro ti sakit iti panawen ti, Yi+1 = kinakaro ti sakit iti sumaruno a panawen ti+1, ti = oras ti umuna a panagrukod (kadagiti aldaw), ti+1 = oras ti sumaganad a panagrukod (kadagiti aldaw), n = dagup a bilang dagiti puntos ti panawen wenno dagiti puntos ti panagpaliiw. Dagiti parametro ti panagdakkel ti mula ti saba agraman ti kangato ti mula (cm), bilang dagiti sanga iti tunggal mula, ken bilang dagiti bulong iti tunggal mula ket nairekord iti linawas iti 21 nga aldaw kadagiti amin a biolohikal a replika.
Iti tunggal biolohikal a replika, dagiti sample ti bulong (maikadua ken maikatlo a naan-anay a narang-ay a bulong manipud iti ngato) ket naurnong iti aldaw 45 kalpasan ti pannakaagas (15 nga aldaw kalpasan ti naudi a pannakaagas). Tunggal biolohikal a replika ket buklen ti lima a kaldero (dua a mula iti tunggal kaldero). Agarup a 500 mg ti narumek a tisyu ket naus-usar para iti panagala kadagiti potosintetiko a pigmento (kloropila a, kloropila b ken dagiti karotenoid) babaen ti panagusar ti 80% nga acetone iti 4 °C iti nasipnget. Kalpasan ti 24 h, dagiti sample ket nasentripugo ken ti supernatant ket naurnong para iti panangikeddeng ti linaon ti kloropila a, kloropila b ken karotenoid a kolorimetriko babaen ti panagusar ti UV-160A nga espektrofotometro (Shimadzu Corporation, Japan) segun ti pamay-an ti (Lichtenthaler, 1987) babaen ti panangrukod ti panagsebseb iti tallo a nadumaduma nga atiddog ​​ti allon (A470, A646 ken A663 nm). Kamaudiananna, ti linaon dagiti potosintetiko a pigmento ket nakuenta babaen ti panagusar kadagiti sumaganad a pormula 4–6 nga inladawan babaen ni Lichtenthaler (1987).
Iti 72 h kalpasan ti pannakaagas (hpt), dagiti bulong (maikadua ken maikatlo a naan-anay a narang-ay a bulong manipud iti ngato) ket naurnong manipud iti tunggal maysa a biolohiko a replika para iti in situ a histokemikal a lokalisasion ti hidrohena a peroksida (H2O2) ken superokside nga anion (O2•−). Tunggal biolohikal a replika ket buklen ti lima a kaldero (dua a mula iti tunggal kaldero). Tunggal biolohikal a replika ket naanalisar iti doble (dua a teknikal a replika) tapno masigurado ti kinaumiso, kinamapagtalkan ken pannakapaadu ti pamay-an. Ti H2O2 ken O2•− ket naikeddeng babaen ti panagusar ti 0.1% a 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) wenno nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania), a nagsasaruno, babaen ti panangsurot kadagiti pamay-an nga inladawan babaen ni Romero-Puertas et al. (2004) ken ni Adam et al. (1989) nga addaan kadagiti babassit a panagbalbaliw. Para iti histokemikal a lokalisasion ti H2O2 in situ, dagiti leaflet ket na-vacuum infiltrated babaen ti 0.1% DAB iti 10 mM Tris buffer (pH 7.8) ken kalpasanna naipatakder iti temperatura ti kuarto iti lawag iti 60 min. Napaputi dagiti leaflet iti 0.15% (v/v) TCA iti 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ken kalpasanna naiparang iti lawag agingga a sumipngetda. Kasta met, dagiti balbula ket vacuum infiltrated babaen ti 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) a naglaon ti 0.1 w/v % HBT para iti histokemikal a lokalisasion ti O2•− in situ. Dagiti leaflet ket naipatakder iti lawag iti temperatura ti siled iti 20 min, kalpasanna napaputi a kas iti ngato, ken kalpasanna nasilawan agingga a nagparang dagiti natayengteng nga asul/violet a mantsa. Ti kapigsa ti nagbanagan a kayumanggi (kas maysa nga H2O2 a mangipakita) wenno asul-violet (kas maysa nga O2•− a mangipakita) a kolor ket natakderan babaen ti panagusar ti bersion ti Fiji ti pakete ti panagproseso ti ladawan nga ImageJ (http://fiji.sc; naala idi 7 Marso 2024).
Ti malondialdehyde (MDA; kas maysa a markador ti lipido a peroksidasion) ket naikeddeng segun ti pamay-an da Du ken Bramlage (1992) nga addaan kadagiti bassit a panagbalbaliw. Dagiti bulong manipud iti tunggal biolohikal a replika (maikadua ken maikatlo a naan-anay a narang-ay a bulong manipud iti ngato) ket naurnong 72 h kalpasan ti pannakaagas (hpt). Tunggal biolohikal a replika ket nairaman ti lima a kaldero (dua a mula iti tunggal kaldero). Tunggal biolohikal a replika ket naanalisar iti doble (dua a teknikal a replika) tapno masigurado ti kinaumiso, kinamapagtalkan ken pannakapaadu ti pamay-an. Iti apagbiit, 0.5 g ti giniling a tisyu ti bulong ti nausar para iti MDA extraction nga addaan iti 20% trichloroacetic acid (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) a naglaon iti 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kalpasanna ti linaon ti MDA iti supernatant ket naikeddeng a kolorimetriko babaen ti panangrukod ti panagsebseb iti 532 ken 600 nm babaen ti panagusar ti UV-160A nga espektrofotometro (Shimadzu Corporation, Japan) ken kalpasanna naiyebkas a kas nmol g−1 FW.
Para iti panangtingiting kadagiti saan nga enzymatic ken enzymatic antioxidants, dagiti bulong (maikadua ken maikatlo a naan-anay a narang-ay a bulong manipud iti ngato) ket naurnong manipud iti tunggal biolohikal a replika iti 72 h kalpasan ti pannakaagas (hpt). Tunggal biolohikal a replika ket buklen ti lima a kaldero (dua a mula iti tunggal kaldero). Tunggal biolohikal a sample ket naanalisar iti doble (dua a teknikal a sample). Dua a bulong ti napagiling babaen ti likido a nitroheno ken direkta a nausar para iti panangikeddeng kadagiti enzymatic ken non-enzymatic antioxidants, dagup nga amino acids, linaon ti proline, gene expression, ken oxalate quantification.
Dagiti dagup a matunaw a phenolics ket naikeddeng babaen ti panagusar ti Folin-Ciocalteu a reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) nga addaan kadagiti bassit a panagbalbaliw ti pamay-an nga inladawan babaen ni Kahkonen et al. (1999) nga . Iti apagbiit, agarup a 0.1 g ti homogenized leaf tissue ket naala babaen ti 20 ml 80% methanol iti nasipnget iti 24 h ken ti supernatant ket naurnong kalpasan ti centrifugation. Ti 0.1 ml ti sample extract ket nalaokan iti 0.5 ml a Folin-Ciocalteu reagent (10%), napagkintayeg iti 30 s ken nabaybay-an iti nasipnget iti 5 min. Kalpasanna ti 0.5 ml ti 20% a sodium carbonate solution (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ket nainayon iti tunggal tubo, nalaokan a naimbag ken naipatakder iti temperatura ti siled iti nasipnget iti 1 h. Kalpasan ti panaginkubasion, ti panagsebseb ti naglaok a reaksion ket narukod iti 765 nm babaen ti panagusar ti UV-160A nga espektrofotometro (Shimadzu Corporation, Japan). Ti konsentrasion ti dagup a matunaw a phenols kadagiti sample extracts ket naikeddeng babaen ti panagusar ti gallic acid calibration curve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ken naiyebkas a kas miligramo ti gallic acid a katupag iti tunggal gramo ti presko a dagsen (mg GAE g-1 a presko a dagsen).
Ti dagup a matunaw a linaon ti flavonoid ket naikeddeng segun ti pamay-an ni Djeridane et al. (2006) nga addaan kadagiti bassit a panagbalbaliw. Iti apagbiit, ti 0.3 ml ti nadakamat a methanol extract ket nalaokan iti 0.3 ml ti 5% aluminum chloride solution (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), napigsa a napaglalaok ken kalpasanna naipatakder iti temperatura ti siled iti 5 min, a sinaruno babaen ti pannakainayon ti 0.3 ml ti 10% a potassium acetate solution (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), naan-anay a nalaokan ken naipatakder iti temperatura ti siled iti 30 min iti nasipnget. Kalpasan ti panaginkubasion, ti panagsebseb ti naglaok a reaksion ket narukod iti 430 nm babaen ti panagusar ti UV-160A nga espektrofotometro (Shimadzu Corporation, Japan). Ti konsentrasion ti dagup a matunaw a flavonoid kadagiti sample a naala ket naikeddeng babaen ti panagusar ti kurba ti kalibrasion ti rutin (TCI America, Portland, OR, USA) ken kalpasanna naiyebkas a kas miligramo ti katupag ti rutin iti tunggal gramo ti presko a dagsen (mg RE g-1 a presko a dagsen).
Ti dagup a nawaya nga amino acid a linaon dagiti bulong ti saba ket naikeddeng babaen ti panagusar ti nabaliwan a ninhydrin reagent (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) a naibatay iti pamay-an nga insingasing babaen da Yokoyama ken Hiramatsu (2003) ken nabaliwan babaen ni Sun et al. (2006) nga . Iti apagbiit, 0.1 g ti ground tissue ket naala babaen ti pH 5.4 buffer, ken ti 200 μL ti supernatant ket nareaksion iti 200 μL ti ninhydrin (2%) ken 200 μL ti pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), a naipatakder iti agburburek a danum a pagdigusan iti 30 min, kalpasanna nalamiis ken narukod iti 580 nm babaen ti panagusar ti UV-160A nga espektrofotometro (Shimadzu Corporation, Hapon). Iti sabali a bangir, ti prolina ket naikeddeng babaen ti pamay-an ti Bates (Bates et al., 1973). Ti prolina ket naala babaen ti 3% a sulfosalicylic acid (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ken kalpasan ti centrifugation, 0.5 ml ti supernatant ket nalaokan iti 1 ml a glacial acetic acid (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ken ninhydrin reagent, naipatakder iti 90°C iti 45 min, nalamiis ken narukod iti 520 nm nga agus-usar ti isu met laeng nga espektrofotometro a kas iti ngato. Ti dagup a nawaya nga amino acids ken proline kadagiti leaf extracts ket naikeddeng babaen ti panagusar kadagiti glycine ken proline calibration curves (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), agpada, ken naiyebkas a kas mg/g a presko a dagsen.
Tapno maikeddeng ti ensimatiko nga aktibidad dagiti antioksidante nga enzyme, agarup a 500 mg ti homogenized tissue ket naala babaen ti 3 ml ti 50 mM Tris buffer (pH 7.8) a naglaon ti 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ken 7.5% a polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, . USA), nasentripugo iti 10,000 × g iti 20 min iti sidong ti panagpalamiis (4 °C), ken ti supernatant (krudo nga enzyme extract) ket naurnong (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Kalpasanna ti Catalase (CAT) ket nareaksion iti 2 ml ti 0.1 M a sodium phosphate buffer (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ken 100 μl ti 269 mM a solusion ti H2O2 tapno maikeddeng ti ensimatiko nga aktibidadna segun ti pamay-an ni Aebi (1984) nga addaan kadagiti bassit a panagbalbaliw (El-Nagar et al., 2023; Osman ken dagiti kakaduana, 2023). Ti guaiacol-dependent peroxidase (POX) nga ensimatiko nga aktibidad ket naikeddeng babaen ti panagusar ti pamay-an ni Harrach et al. (2009) nga . (2008) nga addaan kadagiti babassit a panagbalbaliw (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ken ti ensimatiko nga aktibidad ti polyphenol oxidase (PPO) ket naikeddeng kalpasan ti reaksion iti 2.2 ml ti 100 mM a sodium phosphate buffer (pH 6.0), 100 μl ti guaiacol (TCI a kemikal, Portland, OR, . USA) ken 100 μl ti 12 mM H2O2. Ti pamay-an ket nabaliwan bassit manipud iti (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ti panagsukimat ket naaramid kalpasan ti reaksion babaen ti 3 ml ti solusion ti catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) a baro a naisagana iti 0.1 M a phosphate buffer (pH 6.0). Ti aktibidad ti CAT ket narukod babaen ti panangmonitor ti panagrunaw ti H2O2 iti 240 nm (A240), ti aktibidad ti POX ket narukod babaen ti panangmonitor ti panagngato ti panagsebseb iti 436 nm (A436), ken ti aktibidad ti PPO ket narukod babaen ti panagirekord kadagiti panagbalbaliw ti panagsebseb iti 495 nm (A495) iti tunggal maysa a 30 s iti 3 min babaen ti panagusar ti UV-160A espektrofotometro (Shimadzu, Hapon).
Ti aktual nga oras nga RT-PCR ket naus-usar a mangduktal kadagiti lebel ti transkripsion ti tallo a mainaig iti antioksidante a gene, a mairaman ti peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ken glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No.. KY195009.1), kadagiti bulong ti saba (ti maikadua ken maikatlo a naan-anay a narang-ay a bulong manipud iti ngato) 72 h kalpasan ti naudi a pannakaagas. Iti apagbiit, naisina ti RNA babaen ti Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) segun iti protocol ti agpatpataud. Kalpasanna, nasintisisar ti cDNA babaen ti TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit sigun kadagiti instruksion ti managaramid. Dagiti panagsasaruno ti primer dagiti tallo a gene iti ngato ket nailista iti Supplementary Table S3. Ti PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) ket naus-usar a kas ti gene ti panagtagibalay ken ti relatibo a gene nga ebkas ket nakuenta babaen ti panagusar ti 2-ΔΔCT a pamay-an ( Livak ken Schmittgen, 2001 ). Ti kinatalged ti actin iti sidong ti biotiko a panagbannog (saan a maitunos a panagtitinnulong iti nagbaetan dagiti gagangay a legumbre ken ti fungus ti anthracnose a Colletotrichum lindemuthiaanum) ken ti abiotiko a panagbannog (tikag, kinaapgad, nababa a temperatura) ket naipakita (Borges et al., 2012).
Immuna nga inaramidmi ti genome-wide in silico a panaganalisar kadagiti protina ti oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) iti S. sclerotiorum babaen ti panagusar ti protina-protina a ramit ti BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Iti apagbiit, inus-usarmi ti OAH manipud iti Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; takside: 1191702; numero ti panagserrek ti GenBank XP_040799428.1; 342 nga amino asido) ken Penicillium lagena (PlOAH; taksida: 94218; numero ti panagserrek ti GenBank XP_056833920.1;316 nga amino asido) a kas dagiti panagsasaruno ti panagsaludsod tapno mamapa ti homologo a protina iti S. sclerotiorum (taxide: 5180). Ti BLASTp ket naaramid a maibusor kadagiti kaudian a magun-od a datos ti genome ti S. sclerotiorum idiay GenBank iti Nailian a Sentro para iti Impormasion ti Bioteknolohia (NCBI) a website, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Iti pay maipatinayon, ti naipadto nga OAH a gene manipud iti S. sclerotiorum (SsOAH) ken ti ebolusionario a panaganalisar ken pilohenetiko a kayo ti AfOAH manipud iti A. fijiensis CBS 313.89 ken PlOAH manipud iti P. lagena ket naipanunotan babaen ti panagusar ti maximum likelihood a pamay-an iti MEGA11 (Tamura et al., 2021) ken ti JTT matrix-based model (Jones et al., 1992) ken ni. Ti pilohenetiko a kayo ket naitipon iti adu a panagitunos a panaganalisar kadagiti panagsasaruno ti protina dagiti amin a naipadto nga OAH a gene (SsOAH) manipud iti S. sclerotiorum ken ti panagsasaruno ti panagsaludsod babaen ti panagusar ti Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ken Agarwala, 2007). Iti pay maipatinayon, dagiti kasayaatan a maitunos nga amino asido a panagsasaruno ti SsOAH manipud iti S. sclerotiorum ket naitunos kadagiti panagsasaruno ti panagsaludsod (AfOAH ken PlOAH) (Larkin et al., 2007) babaen ti panagusar ti ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ken dagiti napreserba a rehion iti panagtunos ket nailadawan babaen ti panagusar ti ramit ti ESPript (bersion 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ti panagadal ti panagbiag ti tao.
Iti pay maipatinayon, dagiti naipadto a panagandar a pannakabagi a dominio ken dagiti napreserba a lugar ti S. sclerotiorum SsOAH ket interaktibo a naidasig kadagiti nadumaduma a pamilia babaen ti panagusar ti ramit ti InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Kamaudiananna, ti tallo-dimensional (3D) a panagmodelo ti estruktura ti naipadto nga S. sclerotiorum SsOAH ket naaramid babaen ti panagusar ti Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server bersion 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ken nabalido babaen ti panagusar ti serbidor ti SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Dagiti naipadto a tallo-dimensional nga estruktura (pormat ti PDB) ket interaktibo a nailadawan babaen ti panagusar ti pakete ti UCSF-Chimera (bersion 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Ti kuantitatibo nga aktual nga oras a fluorescence PCR ket naus-usar a mangikeddeng ti transkripsional a lebel ti oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) iti mycelia ti Sclerotinia sclerotiorum. Iti apagbiit, ti S. sclerotiorum ket nai-inokulado iti prasko a naglaon iti PDB ken naikabil iti agtayyek nga incubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) iti 25 ± 2 °C iti 24 h iti 150 rpm ken iti kanayon a sipnget (24 h) tapno mangtignay iti panagdakkel ti mycelial. Kalpasanna, dagiti selula ket naagasan babaen ti L-ornithine ken ti fungicide a Rizolex-T kadagiti maudi a konsentrasion ti IC50 (agarup a 40 ken 3.2 mg/L, agpada) ken kalpasanna nakultura iti sabali pay a 24 h iti sidong dagiti isu met laeng a kasasaad. Kalpasan ti panaginkubasion, dagiti kultura ket nasentripugo iti 2500 rpm iti 5 min ken ti supernatant (fungal mycelium) ket naurnong para iti gene expression analysis. Kasta met, ti fungal mycelium ket naurnong iti 0, 24, 48, 72, 96, ken 120 h kalpasan ti impeksion manipud kadagiti naimpektaran a mula a nangporma iti puraw nga amag ken cottony mycelium iti rabaw dagiti naimpektaran a tisyu. Ti RNA ket naala manipud iti fungal mycelium ken kalpasanna ti cDNA ket nasintisisar a kas nailadawan iti ngato. Dagiti panagsasaruno ti primer para iti SsOAH ket nailista iti Supplementario a Tabla S3. Ti SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) ket naus-usar a kas ti gene ti panagtagibalay, ken ti relatibo a gene nga ebkas ket nakuenta babaen ti panagusar ti 2-ΔΔCT a pamay-an ( Livak ken Schmittgen, 2001 ).
Ti oxalic acid ket naikeddeng iti patatas a dextrose broth (PDB) ken dagiti sample ti mula a naglaon ti fungal a patoheno a Sclerotinia sclerotiorum segun ti pamay-an da Xu ken Zhang (2000) nga addaan kadagiti bassit a panagbalbaliw. Iti apagbiit, dagiti naibukod a S. sclerotiorum ket nai-inokulado kadagiti prasko a naglaon ti PDB ken kalpasanna nakultura iti agtayyek nga incubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) iti 150 rpm iti 25 ± 2 °C iti 3–5 nga aldaw iti agtultuloy a kinasipnget (24 h) tapno mangtignay iti panagdakkel ti mycelial. Kalpasan ti panaginkubasion, ti kultura ti fungus ket umuna a nasala babaen ti Whatman #1 filter paper ken kalpasanna nasentripugo iti 2500 rpm iti 5 min tapno maikkat ti nabati a mycelium. Ti supernatant ket naurnong ken naidulin iti 4°C para iti ad-adu pay a kantitatibo a panangikeddeng ti oxalate. Para iti panagisagana kadagiti sample ti mula, agarup a 0.1 g ti pirgis ti tisyu ti mula ket naala iti mamitlo babaen ti nadistilo a danum (2 ml iti tunggal gundaway). Kalpasanna dagiti sample ket nasentripugo iti 2500 rpm iti 5 min, ti supernatant ket namaga a nasala babaen ti Whatman No. 1 a papel ti pagsala ken naurnong para iti kanayonan a panaganalisar.
Para iti kantitatibo a panaganalisar ti oxalic acid, ti reaksion a naglaok ket naisagana iti sarming a naisardeng a tubo iti sumaganad nga urnos: 0.2 ml ti sample (wenno PDB culture filtrate wenno oxalic acid standard solution), 0.11 ml ti bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml ti 1 M sulfuric acid (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ken 0.176 ml ti 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), ket kalpasanna ti solusion ket nabartek iti 4.8 ml babaen ti nadistilo a danum, napigsa a nalaokan ken dagus a naikabil iti 60 °C a danum digos. Kalpasan ti 10 min, ti reaksion ket naisardeng babaen ti pananginayon ti 0.5 ml ti solusion ti sodium hydroxide (NaOH; 0.75 M). Ti absorbance (A600) ti reaksion a naglaok ket narukod iti 600 nm babaen ti panagusar ti UV-160 nga espektrofotometro (Shimadzu Corporation, Japan). Ti PDB ken distilled water ket nausar a kas kontrol para iti pannakakuantipika dagiti culture filtrate ken dagiti sample ti mula, agpada. Dagiti konsentrasion ti oxalic acid kadagiti pagsala ti kultura, a naiyebkas a kas dagiti mikrogramo ti oxalic acid iti tunggal mililitro ti PDB medium (μg.mL−1), ken kadagiti naala ti bulong, a naiyebkas a kas dagiti mikrogramo ti oxalic acid iti tunggal gramo ti presko a dagsen (μg.g−1 FW), ket naikeddeng babaen ti panagusar ti kurba ti kalibrasion ti oxalic acid (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Iti intero a panagadal, amin nga eksperimento ket nadisenio iti naan-anay a randomized design (CRD) nga addaan iti innem a biolohikal a replika iti tunggal panangagas ken lima a kaldero iti tunggal biolohikal a replika (dua a mula iti tunggal kaldero) malaksid no naibaga ti sabali. Naanalisar dagiti biolohikal a replikado iti doble (dua a teknikal a replika). Dagiti teknikal a replikado ket naus-usar a mangsukimat ti pannakapaadu ti isu met laeng nga eksperimento ngem saan a naus-usar iti estadistikal a panaganalisar tapno maliklikan dagiti palso a replika. Dagiti datos ket estadistikal a naanalisar babaen ti panagusar ti panaganalisar ti panagdumaduma (ANOVA) a sinaruno babaen ti Tukey-Kramer a napudno a naisangsangayan a panagdumaduma (HSD) a panagsubok (p ≤ 0.05). Para kadagiti in vitro nga eksperimento, dagiti pateg ti IC50 ken IC99 ket nakuenta babaen ti panagusar ti modelo ti probit ken dagiti 95% a panagtalek nga aggigiddan ket nakuenta.
Agdagup iti uppat nga isolates ti naurnong manipud iti nadumaduma a talon ti soybean idiay El Ghabiya Governorate, Egypt. Iti PDA medium, amin a naibukod ket nakapataud iti krema a puraw a mycelium a napardas a nagbalin a kapas a puraw (Pigura 1A) ken kalpasanna beige wenno kayumanggi iti tukad ti sclerotium. Ti sclerotia ket kadawyan a napuskol, nangisit, nagtimbukel wenno saan a regular ti sukog, 5.2 aginggana iti 7.7 mm ti kaatiddog ​​ken 3.4 aginggana iti 5.3 mm ti diametro (Pigura 1B). Urayno uppat a naibukod ket nakapataud ti marginal a padron ti esklerotia iti igid ti medium ti kultura kalpasan ti 10–12 nga aldaw ti panaginkubasion iti 25 ± 2 °C ( Fig. 1A ), ti bilang dagiti esklerotia iti tunggal maysa a plato ket naisangsangayan a naiduma kadagitoy ( P < 0.001), nga addaan ti naibukod a 3 nga addaan iti kangatuan a bilang ti esklerotia (32.33 ± 1.53 nga esklerotia iti tunggal maysa plato nga Fig. 1C). Kasta met, ti isolate #3 ket nangpataud ti ad-adu nga oxalic acid iti PDB ngem dagiti dadduma nga isolates (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fig. 1D). Ti Isolate #3 ket nangipakita kadagiti gagangay a morpolohiko ken mikroskopiko a pakabigbigan ti phytopathogenic a fungus a Sclerotinia sclerotiorum. Kas pagarigan, iti PDA, dagiti kolonia ti isolate #3 ket napardas a dimmakkel, krema a puraw (Pigura 1A), baliktad a beige wenno nalawag a salmon a duyaw-kayumanggi, ken kasapulan ti 6-7 nga aldaw iti 25 ± 2°C tapno naan-anay a maabbongan ti rabaw ti 9 cm a diametro a plato. Maibatay kadagiti morpolohiko ken mikroskopiko a kababalin iti ngato, ti isolate #3 ket nailasin a kas ti Sclerotinia sclerotiorum.
Pigura 1. Karakteristiko ken pathogenicity dagiti naisina ti S. sclerotiorum manipud kadagiti gagangay nga apit ti legume. (A) Mycelial growth ti uppat nga S. sclerotiorum isolates iti PDA medium, (B) sclerotia ti uppat nga S. sclerotiorum isolates, (C) bilang ti sclerotia (kada plato), (D) oxalic acid secretion iti PDB medium (μg.mL−1), ken (E) kinakaro ti sakit (%) ti uppat nga S. sclerotiorum isolates iti nalaka a maawat a komersial a legume kultibar Giza 3 iti sidong ti kasasaad ti greenhouse. Dagiti pateg ket mangibagi ti kaaduan ± SD ti lima a biolohiko a replikado (n = 5). Dagiti nadumaduma a letra ket mangipakita kadagiti estadistikal a naisangsangayan a panagdumaduma iti nagbaetan dagiti panangagas (p < 0.05). (F–H) Nagparang dagiti gagangay a sintoma ti puraw nga amag kadagiti puon iti ngato ti daga ken siliques, agpada, 10 nga aldaw kalpasan ti pannakabakuna iti isolate #3 (dpi). (I) Ti ebolusionario a panaganalisar ti internal transcribed spacer (ITS) a rehion ti S. sclerotiorum isolate #3 ket naaramid babaen ti panagusar ti maximum likelihood a pamay-an ken naipadpada kadagiti 20 a reperensia nga isolates/strains a naala manipud iti National Center for Biotechnology Information (NCBI) a database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dagiti numero iti ngato dagiti linia ti panagurnong ket mangipakita ti sakup ti rehion (%), ken dagiti numero iti baba dagiti linia ti panagurnong ket mangipakita ti kaatiddog ​​ti sanga.
Maysa pay, tapno mapasingkedan ti pathogenicity, uppat a nagun-od nga S. sclerotiorum isolates ti nausar a mangibakuna iti nalaka a maakaran a komersial a kultibar ti saba a Giza 3 iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse, a maitunos kadagiti postulate ni Koch ( Fig. 1E ). Urayno amin dagiti nagun-od a fungal isolates ket patoheniko ken mabalin a mang-impektar iti berde a bean (cv. Giza 3), a pakaigapuan dagiti gagangay a sintoma ti puraw nga amag kadagiti amin a paset iti ngato ti daga (Fig. 1F), nangruna kadagiti puon (Fig. 1G) ken pods (Fig. 1H) iti 10 nga aldaw kalpasan ti inokulasion (dpi), ti isolate 3 ti kaaduan nga agresibo a naibukod iti dua nga agwaywayas nga eksperimento. Ti Isolate 3 ket addaan iti kangatuan a kinakaro ti sakit (%) kadagiti mula a bean (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, ken 76.7 ± 3.1 iti 7, 14, ken 21 nga aldaw kalpasan ti impeksion, agpada; Figure 1F).
Ti pannakailasin ti kaaduan a makaraut nga S. sclerotiorum isolate #3 ket ad-adda a napasingkedan a naibatay iti akin-uneg a transcribed spacer (ITS) a panagsasaruno ( Fig. 1I ). Ti pilohenetiko a panaganalisar iti nagbaetan ti naibukod #3 ken 20 a reperensia a naibukod/dagiti kita ket nangipakita ti nangato a panagpapada (>99%) iti nagbaetan dagitoy. Maipalagip a ti S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) ket addaan iti nangato a panagpapada iti American S. sclerotiorum isolate LPM36 a naisina manipud kadagiti namaga a bukel ti gisantes (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) ken ti Chinese S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession number OR206374.1;548 bp), a pakaigapuan ti panagrunot ti puon ti violet (Matthiola incana), amin dagitoy ket nagrupo a naisina iti tuktok ti dendrogram (Pigura 1I). Ti baro a panagsasaruno ket naideposito iti database ti NCBI ken napanaganan iti “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792). Makita a ti isolate 3 ti kaaduan a makaraut nga isolate; ngarud, daytoy a naibukod ket napili para iti panagadal kadagiti amin a simmaruno nga eksperimento.
Ti antibakterial nga aktibidad ti diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) iti nadumaduma a konsentrasion (12.5, 25, 50, 75, 100 ken 125 mg/L) a maibusor iti S. sclerotiorum isolate 3 ket naimbestigaan iti in vitro. Maipalagip a ti L-ornithine ket nangiparang ti antibakterial nga epekto ken in-inut a nanglapped ti radial a panagdakkel ti S. sclerotiorum hyphae iti dosis-a-nagdepende a wagas (Pigura 2A, B). Iti kangatuan a konsentrasion a nasubok (125 mg/L), ti L-ornithine ket nangipakita ti kangatuan a mycelial growth inhibition rate (99.62 ± 0.27%; Figura 2B), a katupag ti komersial a fungicide a Rizolex-T (inhibition rate 99.45 ± 0.39%; Figura 2C) iti kangatuan a konsentrasion a nasubok (10 mg/L), a mangipakpakita ti kapada epektibo ti kinaepektibo.
Pigura 2. In vitro nga antibakterial nga aktibidad ti L-ornithine kontra iti Sclerotinia sclerotiorum. (A) Panagpada ti antibacterial nga aktibidad ti nadumaduma a konsentrasion ti L-ornithine kontra iti S. sclerotiorum iti komersial a fungicide a Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Inhibition rate (%) ti panagdakkel ti mycelial ti S. sclerotiorum kalpasan ti pannakaagas iti nadumaduma a konsentrasion ti L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 ken 125 mg/L) wenno Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ken 10 mg/L), agpada. Dagiti pateg ket mangibagi ti kaaduan ± SD ti lima a biolohiko a replikado (n = 5). Dagiti nadumaduma a letra ket mangipakpakita kadagiti estadistikal a panagdumaduma iti nagbaetan dagiti panangagas (p < 0.05). (D, E) Probit model regresion analysis ti L-ornithine ken komersial a fungicide Rizolex-T, agpada. Ti linia ti panagsubli ti modelo ti probit ket naipakita a kas ti solido nga asul a linia, ken ti panagtalek nga aggigiddan (95%) ket naipakita a kas ti nagtimbukel a nalabaga a linia.
Mainayon pay, naaramid ti probit regression analysis ken dagiti maitunos a plot ket naipakita iti Table 1 ken Figures 2D,E. Iti apagbiit, ti maawat a pateg ti bakras (y = 2.92x − 4.67) ken dagiti nainaig a naipangpangruna nga estadistika (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ken p < 0.0001; Figura 2D) ti L-ornithine ket nangipamatmat ti naparang-ay nga antifungal nga aktibidad a maibusor iti S. sclerotiorum no maidilig iti komersial a fungicide Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ken p < 0.0001) (Tabla 1).
Table 1. Dagiti pateg ti kagudua-maximum inhibitory concentration (IC50) ken IC99 (mg/l) ti L-ornithine ken komersial a fungicide a “Rizolex-T” kontra iti S. sclerotiorum.
Iti pakabuklan, ti L-ornithine (250 mg/L) ket nangruna a nangkissay ti panagrang-ay ken kinakaro ti puraw nga amag kadagiti naagasan a gagangay a mula ti saba no idilig kadagiti saan a naagasan a mula a naimpektaran iti S. sclerotiorum (kontrol; Figura 3A). Iti apagbiit, nupay ti kinakaro ti sakit dagiti saan a naagasan a naimpektaran a kontrol a mula ket in-inut nga immadu (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ken 92.33 ± 3.06%), ti L-ornithine ket nangruna a nangkissay ti kinakaro ti sakit (%) iti intero nga eksperimento (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ken 26.36 ± 3.07) iti 7, 14, ken 21 nga aldaw kalpasan ti pannakaagas (dpt), agpada (Pigura 3A). Kasta met, idi dagiti mula a bean a naimpektaran iti S. sclerotiorum ket naagasan iti 250 mg/L L-ornithine, bimmaba ti kalawa iti baba ti disease progression curve (AUDPC) manipud 1274.33 ± 33.13 iti saan a naagasan a kontrol agingga iti 281.03 ± 7.95, a nababbaba bassit ngem iti positibo a kontrol a 50 mg/L Rizolex-T a fungicide (183.61 ± 7.71; Fig. 3B). Kasta met laeng nga uso ti napaliiw iti maikadua nga eksperimento.
Fig. 3. Epekto ti exogenous application ti L-ornithine iti panagdakkel ti puraw a panagrunot ti gagangay a saba a gapuanan ti Sclerotinia sclerotiorum iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse. (A) Kurba ti panagrang-ay ti sakit ti puraw nga amag ti gagangay a bean kalpasan ti pannakaagas iti 250 mg/L L-ornithine. (B) Lugar iti sirok ti disease progression curve (AUDPC) ti puraw nga amag ti gagangay a bean kalpasan ti pannakaagas iti L-ornithine. Dagiti pateg ket mangibagi ti kaaduan ± SD ti lima a biolohiko a replikado (n = 5). Dagiti nadumaduma a letra ket mangipakpakita kadagiti estadistikal a naipangpangruna a panagdumaduma iti nagbaetan dagiti panangagas (p < 0.05).
Ti exogenous application ti 250 mg/L L-ornithine ket in-inut a nangipangato ti kangato ti mula (Fig. 4A), bilang dagiti sanga iti tunggal mula (Fig. 4B), ken bilang dagiti bulong iti tunggal mula (Fig. 4C) kalpasan ti 42 nga aldaw. Bayat a ti komersial a fungicide a Rizolex-T (50 mg/L) ket addaan iti kadakkelan nga epekto kadagiti amin a nutrisional a parametro a naadal, ti exogenous a panagipakat ti 250 mg/L L-ornithine ket addaan iti maikadua a kadakkelan nga epekto no idilig kadagiti saan a naagasan a kontrol ( Figs. 4A–C ). Iti sabali a bangir, ti panangagas iti L-ornithine ket awan ti dakkel nga epektona iti linaon dagiti potosintetiko a pigmento a kloropila a ( Fig. 4D ) ken kloropila b ( Fig. 4E ), ngem bassit a nangipangato ti dagup a linaon ti carotenoid (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) no idilig iti negatibo a kontrol (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) ken positibo a kontrol (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Iti pakabuklan, dagitoy a resulta ipamatmatda a ti L-ornithine ket saan a phytotoxic kadagiti naagasan a legumes ken mabalin pay ketdi a mangtignay iti panagdakkelda.
Fig. 4. Epekto ti exogenous L-ornithine application kadagiti kababalin ti panagdakkel ken photosynthetic pigments dagiti bulong ti saba a naimpektaran iti Sclerotinia sclerotiorum iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse. (A) Katayag ti mula (cm), (B) Bilang dagiti sanga iti tunggal mula, (C) Bilang ti bulong iti tunggal mula, (D) Linaon ti chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) Linaon ti chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) Dagup a linaon ti carotenoid (mg g-1 fr wt). Dagiti pateg ket ti kaaduan ± SD ti lima a biolohiko a replikado (n = 5). Dagiti nadumaduma a letra ket mangipakita kadagiti estadistikal a naisangsangayan a panagdumaduma iti nagbaetan dagiti panangagas (p < 0.05).
Ti in situ a histokemikal a lokalisasion dagiti reaktibo a sebbangan ti oksiheno (ROS; naiyebkas a kas ti hidroheno a peroksida [H2O2]) ken dagiti nawaya a radikal (naiyebkas a kas dagiti superoksida nga anion [O2•−]) ket nangipalgak a ti exoheno a panagipakat ti L-ornithine (250 mg/L) ket nangruna a nangkissay ti panagurnong ti H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) ken O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) no idilig iti panagurnong ti agpada a saan a naagasan a naimpektaran a mula (173.31 ± 12.06 ken 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, agpada) ken dagiti mula a naagasan iti 50 mg/L ti komersial a fungicide Rizolex-T (170.12 ± 9.50 ken 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, agpada) iti 72 h. Nangato a lebel ti H2O2 ken O2•− ti naurnong iti sidong ti hpt ( Fig. 5A, B ). Kasta met, impakita ti TCA-based malondialdehyde (MDA) assay a dagiti mula a saba a naimpektaran iti S. sclerotiorum ket nakaurnong iti nangatngato a lebel ti MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) kadagiti bulongda ( Fig. 5C ). Nupay kasta, ti exogenous a panagusar ti L-ornithine ket nangruna a nangkissay ti lipid peroxidation a kas paneknekan babaen ti panagbaba ti linaon ti MDA kadagiti naagasan a mula (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Epekto ti exogenous L-ornithine application kadagiti kangrunaan a marka ti oxidative stress ken non-enzymatic antioxidant defense mechanisms kadagiti bulong ti saba a naimpektaran iti S. sclerotiorum iti 72 h kalpasan ti impeksion iti sidong dagiti kasasaad ti greenhouse. (A) Hidroheno peroksida (H2O2; nmol g−1 FW) iti 72 hpt, (B) superoksida nga anion (O2•−; nmol g−1 FW) iti 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) iti 72 hpt, (D) dagup a matunaw a phenol (mg GAE g−1 FW) iti 72 hpt, (E) dagup a matunaw a flavonoid (mg RE g−1 FW) iti 72 hpt, (F) dagup a nawaya nga amino asido (mg g−1 FW) iti 72 hpt, ken (G) linaon ti prolina (mg g−1 FW) iti 72 hpt. Dagiti pateg ket mangibagi ti kaaduan ± pagalagadan a panagsisina (kaatiddogan ± SD) ti 5 a biolohiko a replikado (n = 5). Dagiti nadumaduma a letra ket mangipakita kadagiti estadistikal a naisangsangayan a panagdumaduma iti nagbaetan dagiti panangagas (p < 0.05).