Agdama *Agdama nga adres: Cologne 50931, Alemania, Cologne Excellence Cluster Research iti Sungbat ti Cellular Stress kadagiti Sakit a mainaig iti Panaglakayen (CECAD).
Ti neurodegeneration dagiti sakit ti mitochondrial ket naikeddeng a saan a mabaliwan gapu ta ti metaboliko a plastikidad dagiti neuron ket limitado, ngem ti epekto ti mitochondrial a disfunsion iti selula nga autonomia ti neuronal a metabolismo iti bagi ket saan unay a maawatan. Ditoy, iyam-ammomi ti selula-espesipiko a proteoma dagiti neuron ti Purkinje nga addaan iti progresibo a kinakurang ti OXPHOS a gapuanan babaen ti nasinga a dinamika ti panagtipon ti mitochondrial. Natakuatanmi a ti mitochondrial dysfunction ket nangtignay ti nauneg a panagbalbaliw iti tay-ak ti proteomics, a kamaudiananna nangiturong iti agsasaruno a pannakapaaktibo dagiti eksakto a metaboliko a programa sakbay ti ipapatay ti selula. Di ninamnama, inkeddengmi ti nalawag nga induction ti pyruvate carboxylase (PCx) ken dadduma pay nga anti-aging enzymes a mangnayon kadagiti nagbaetan ti siklo ti TCA. Ti pananglapped ti PCx ket nangpakaro ti oxidative stress ken neurodegeneration, a mangipakpakita a ti atherosclerosis ket addaan iti mangsalaknib nga epekto kadagiti neuron nga awanan iti OXPHOS. Ti pannakaisubli ti mitochondrial a panagtipon kadagiti terminal a nadadael a neuron ket naan-anay a mangbaliktad kadagitoy a metaboliko a kababalin, iti kasta malapdan ti ipapatay ti selula. Dagiti natakuatanmi ket mangilasin kadagiti dati a di ammo a dalan a mangipaay iti kinaandur iti mitochondrial dysfunction ken mangipakita a ti neurodegeneration ket mabalin a mabaliktad uray kadagiti naladaw a tukad ti sakit.
Ti sentro nga akem ti mitochondria iti panagtaginayon ti neuronal nga enerhia a metabolismo ket naipaganetget babaen dagiti nasaknap a neurolohiko a sintoma a nainaig kadagiti sakit ti mitochondria ti tao. Kaaduan kadagitoy a sakit ket gapuanan babaen dagiti gene a mutasion a mangregula ti mitochondrial gene expression (1, 2) wenno ti pannakadadael ti gene a mainaig iti mitochondrial dynamics, a saan a direkta nga apektaranna ti kinatalged ti mitochondrial DNA (mtDNA) (3, 4). Ti trabaho kadagiti modelo ti ayup ket nangipakita a kas sungbat ti mitochondrial a disfunsion kadagiti aglawlaw a tisyu, dagiti konserbatibo a metaboliko a dalan (5-7) ket mabalin a mapaaktibo, a mangipaay ti napateg nga impormasion para iti nauneg a pannakaawat ti patogenesis dagitoy a komplikado a sakit. Iti naiduma unay, ti pannakaawattayo kadagiti panagbalbaliw ti metaboliko dagiti espesipiko a kita ti selula a gapuanan ti sapasap a pannakapaay ti panagpataud iti mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) ti utek ket pundamental (8), a mangipaganetget iti pannakasapul a mangilasin kadagiti therapeutic target a mabalin a mausar a manglapped wenno manglapped iti sakit. Lapdan ti neurodegeneration (9). Ti kinakurang ti impormasion ket ti kinapudno a dagiti selula ti nerbio ket nasaknap a maibilang nga addaan iti limitado unay a metaboliko a kinalukneng no idilig kadagiti kita ti selula dagiti aglawlaw a tisyu ( 10 ). No maited a dagitoy a selula ket addaan iti sentro nga akem iti panagkoordinar ti suplay dagiti metabolite kadagiti neuron tapno maitandudo ti sinaptiko a pannakayakar ken sumungbat kadagiti kasasaad ti pannakadangran ken sakit, ti abilidad a mangibagay iti metabolismo ti selula kadagiti makakarit a kasasaad ti tisyu ti utek ket gistay limitado kadagiti selula ti glial ( 11-14 ). Iti pay maipatinayon, ti nainkasigudan a selula a heterogeneidad ti tisyu ti utek ket kaaduan a manglapped ti panagadal kadagiti metaboliko a panagbalbaliw a mapasamak kadagiti espesipiko a neuronal a subgrupo. Kas resultana, bassit laeng ti ammo maipapan kadagiti eksakto a selula ken metaboliko a pagbanagan ti mitochondrial dysfunction kadagiti neuron.
Tapno maawatan dagiti metaboliko a pagbanagan ti mitochondrial dysfunction, insinami dagiti Purkinje neurons (PNs) kadagiti nadumaduma a tukad ti neurodegeneration a gapuanan ti pannakadadael ti mitochondrial outer membrane fusion (Mfn2). Urayno dagiti mutasion ti Mfn2 kadagiti tattao ket nainaig iti maysa a porma ti natawid a motor sensory neuropathy a naamammuan a kas ti Charcot-Marie-Tooth a tipo 2A (15), ti kondisional a pannakadadael ti Mfn2 kadagiti utot ket maysa a nasayaat a mabigbigan nga induction ti oxidation Phosphorylation (OXPHOS) dysfunction a pamay-an. Dagiti nadumaduma a neuronal a subtipo ( 16-19 ) ken ti nagbanagan a neurodegenerative phenotype ket nabuyogan kadagiti progresibo a neurolohiko a sintoma, a kas dagiti sakit ti panaggaraw ( 18 , 19 ) wenno cerebellar ataxia ( 16 ). Babaen ti panagusar ti kombinasion ti label-free quantitative (LFQ) proteomics, metabolomics, imaging, ken virological a pamay-an, ipakitami a ti progresibo a neurodegeneration ket napigsa a mangiduron ti pyruvate carboxylase (PCx) ken dagiti dadduma pay a banag a mairaman iti arteriosclerosis dagiti PN iti vivo Ti panagiyebkas kadagiti enzyme. Tapno mapaneknekan ti kinapateg daytoy a naduktalan, espesipiko nga in-down-regulatedmi ti panagiyebkas ti PCx kadagiti Mfn2-a-kurang a PN, ken nasarakanmi a daytoy nga operasion ket nangpakaro ti oksidatibo a panagbannog ken nangpapartak ti neurodegeneration, iti kasta ket mangpaneknek a ti azoospermia ket mangted ti ipapatay ti selula Metabolic adaptability. Ti nakaro a panagiyebkas ti MFN2 ket mabalin a naan-anay a mangisalakan ti terminal a panagrupsa a PN nga addaan iti nakaro a kinakurang ti OXPHOS, ti dakkel a panagusar ti mitochondrial a DNA, ken agparang a naburak a mitochondrial a network, nga ad-adda a mangipaganetget a daytoy a porma ti neurodegenerasion ket mabalin pay nga umimbag iti narang-ay a tukad ti sakit sakbay ti ipapatay ti selula.
Tapno mailadawan dagiti mitochondria kadagiti Mfn2 knockout PN, nagusarkami iti kita ti ipus a mangipalubos kadagiti Cre-a nakadepende a mitochondria a mangpuntiria iti duyaw a fluorescent protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre nga ebkas ken sinukimatmi ti morpolohia ti mitochondrial iti vivo. Natakuatanmi a ti pannakadadael ti Mfn2 a gene kadagiti PN ket mangiturong iti in-inut a pannakabingbingay ti mitochondrial a network (Pigura S1A), ken ti kasapaan a panagbalbaliw ket nasarakan iti 3 a lawas ti edad. Iti kasumbangirna, ti dakkel a panagrupsa ti PN cell layer, kas paneknekan ti pannakapukaw ti Calbindin immunostaining, ket saan a nangrugi agingga iti 12 a lawas ti edad (Pigura 1, A ken B). Ti di panagtunos ti panawen iti nagbaetan dagiti immuna a panagbalbaliw iti morpolohia ti mitochondrial ken ti makita a panangrugi ti ipapatay ti neuron ti nangtignay kadakami a mangsukimat kadagiti metaboliko a panagbalbaliw a tinignay ti disfunsion ti mitochondrial sakbay ti ipapatay ti selula. Nangaramidkami iti fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based nga estratehia tapno mangisina iti YFP (YFP+)-a mangipakpakita iti PN (Pigura 1C), ken kadagiti kontrol a tukak (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), manipud ditoy ket maawagan a kas CTRL (Pigura S1B). Ti panagoptimisar ti estratehia ti gating a naibatay iti relatibo a kapigsa ti senial ti YFP ket mangipalubos kadatayo a mangdalus ti YFP+ a bagi (YFPhigh) dagiti PN manipud kadagiti saan a PN (YFPneg) (Pigura S1B) wenno dagiti maipagarup a fluorescent nga axon/dendritic a pirgis (YFPlow; Figura S1D, kannigid), a napasingkedan babaen ti konfokal a mikroskopio (Pigura S1D, kannawan). Tapno mapaneknekan ti kinasiasino ti naidasig a populasion, inaramidmi ti LFQ proteomics ken kalpasanna ti prinsipal a paset a panaganalisar, ken nasarakan nga adda ti nalawag a panagsisina iti nagbaetan dagiti selula ti YFPhigh ken YFPneg (Pigura S1C). Dagiti YFPhigh a selula ket nangipakita ti neto a panagpabaknang dagiti ammo a PNs a markador (kayatna a sawen ti Calb1, Pcp2, Grid2 ken Itpr3) (21, 22), ngem awan ti panagpabaknang kadagiti protina a kadawyan a naiyebkas kadagiti neuron wenno dagiti sabali a kita ti selula (Pigura 1D) ). Ti panagidilig ti nagbaetan dagiti sample kadagiti naidasig a YFPhigh a selula a naurnong kadagiti agwaywayas nga eksperimento ket nangipakita ti korelasion a koepisiente> 0.9, a mangipakpakita ti nasayaat a pannakapaadu iti nagbaetan dagiti biolohiko a replika (Pigura S1E). Iti pakagupgopan, dagitoy a datos ket nangvalidate ti planomi para iti acute ken specific isolation ti feasible PN. Gapu ta ti L7-cre a sistema ti drayber a nausar ket mangiduron ti mosaic recombination iti umuna a lawas kalpasan ti panagpasngay ( 23 ), rinugianmi a papatayen dagiti utot manipud iti CTRL ken kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Mangurnong kadagiti neuron. Kalpasan a malpas ti rekombinasion, maawagan daytoy iti Mfn2cKO iti 4 a lawas ti edad. Kas ti punto ti panagpatingga, pinilimi ti 8 a lawas ti edad idi ti PN a suson ket saan a nadadael iti laksid ti nalawag a mitochondrial a panagpirgis ( Figura 1B ken Figura S1A ). Iti dagup, nakuantipikarmi ti dagup a 3013 a protina, a ti agarup a 22% ket naibatay kadagiti MitoCarta 2.0 nga anotasion a naibatay iti mitochondrial a proteome a kas mitochondria (Pigura 1E) (Pigura 1E) (24). Ti differential gene expression analysis a naaramid iti lawas 8 ket nangipakita a 10.5% laeng kadagiti amin a protina ti addaan kadagiti napapateg a panagbalbaliw (Pigura 1F ken Figura S1F), a kadagitoy ket 195 a protina ket down-regulated ken 120 a protina ket up-regulated (Pigura 1F). Maipalagip a ti "makabaro a panaganalisar ti dalan" daytoy a grupo ti datos ket mangipakita a dagiti naidumaduma a naiyebkas a gene ket nangruna a tagikua ti nainget a grupo dagiti espesipiko a metaboliko a dalan (Pigura 1G). Makapainteres, urayno ti downregulation dagiti dalan a mainaig iti OXPHOS ken ti panagsenyas ti kalsium ket mangpasingked ti indusion ti mitochondrial a disfunsion kadagiti fusion-deficient a PN, dagiti sabali a kategoria a nangruna a mairaman ti metabolismo ti amino asido ket nangruna nga upregulated, a daytoy ket maitunos iti metabolismo a mapasamak kadagiti mitochondrial a PN Ti panag-rewiring ket agtultuloy. disfunction ti panagandar.
(A) Dagiti pannakabagi a confocal a retrato dagiti cerebellar a paset dagiti CTRL ken Mfn2cKO a tukak a mangipakpakita iti progresibo a pannakapukaw dagiti PN (calbindin, abuabu); dagiti nukleo ket na-counterstain babaen ti DAPI. (B) Kuantipikasion ti (A) (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance, ***P <0.001; n = 4 agingga iti 6 a sirkulo manipud iti tallo a tukak). (C) Eksperimental nga ayus ti trabaho. (D) Panagwarasto ti mapa ti pudot dagiti markador nga espesipiko iti Purkinje (ngato) ken dadduma pay a kita ti selula (tengnga). (E) Venn diagram a mangipakpakita ti bilang dagiti mitochondrial a protina a nailasin iti naiklasipika a PN. (F) Bulkan a plot dagiti naidumaduma a naiyebkas a protina kadagiti Mfn2cKO a neuron iti 8 a lawas (significance cut-off value ti 1.3). (G) Ti panaganalisar ti dalan ti panagparnuay ket mangipakita kadagiti lima a kapatgan nga up-regulation (nalabaga) ken down-regulation (asul) a dalan iti Mfn2cKO PN a naiklasipika a kas 8 a lawas. Ti promedio a lebel ti panagiyebkas ti tunggal naduktalan a protina ket naipakita. Mapa ti pudot ti grayscale: nabaliwan a pateg ti P. ns, saan a napateg.
Impakita ti datos ti proteomics nga in-inut a bimmaba ti protina nga ebkas dagiti complex I, III, ken IV. Dagiti komplikado I, III, ken IV ket naglaon amin kadagiti nasken nga mtDNA-a naikodigo a subunit, bayat a ti komplikado II, a nuklear-a-naikodigo laeng, ket kangrunaan a saan a naapektaran ( Figura 2A ken Figura S2A ). . Maitunos kadagiti resulta ti proteomics, ti immunohistochemistry dagiti paset ti tisyu ti cerebellar ket nangipakita a ti MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) a subunit a lebel ti komplikado nga IV iti PN ket in-inut a bimmaba (Pigura 2B). Ti mtDNA-naikodigo a subunit a Mtatp8 ket nangruna a naikkat (Pigura S2A), bayat a ti natalged-a-kasasaad a lebel ti nuklear-a-naikodigo nga ATP synthase a subunit ket nagtalinaed a saan a nagbalbaliw, a daytoy ket maitunos iti ammo a natalinaay nga ATP synthase subassembly F1 a komplikado no ti mtDNA a panagiyebkas ket natalged. Agtutunos ti pormasion. Pagsardengen (7). Ti panangtingiting ti lebel ti mtDNA kadagiti naurnos a Mfn2cKO PN babaen ti aktual nga oras a polimerase a kadena a reaksion (qPCR) ket nagpasingked ti in-inut a panagbaba ti bilang ti kopia ti mtDNA. No idilig iti grupo a kontrol, iti 8 a lawas ti edad, agarup laeng a 20% ti mtDNA level ti Nataginayon (Pigura 2C). Maitunos kadagitoy a resulta, ti konfokal a mikroskopia a panagmantsa dagiti Mfn2cKO PN ket naus-usar a mangduktal ti DNA, a mangipakpakita ti panawen-a-nagdepende a panagusar kadagiti mitochondrial a nukleotido (Pigura 2D). Natakuatanmi a dagiti laeng sumagmamano a kandidato a mairaman iti panagdadael ti protina ti mitochondrial ken sungbat ti stress ket up-regulated, a mairaman ti Lonp1, Afg3l2 ken Clpx, ken dagiti OXPHOS a komplikado a panagtitipon a banag. Awan dagiti naduktalan a dakkel a panagbalbaliw kadagiti lebel dagiti protina a mairaman iti apoptosis (Pigura S2B). Kasta met, nasarakanmi a dagiti mitochondria ken endoplasmic reticulum channels a mairaman iti panagitulod ti kalsium ket addaan laeng kadagiti bassit a panagbalbaliw (Pigura S2C). Iti pay maipatinayon, ti panangtingiting kadagiti protina a mainaig iti autophagy ket awan ti nasarakan a naipangpangruna a panagbalbaliw, a maitunos iti makita nga indusion dagiti autophagosoma a napaliiw iti vivo babaen ti immunohistochemistry ken elektron a mikroskopia (Pigura S3). Nupay kasta, ti progresibo nga OXPHOS a disfunsion kadagiti PN ket nabuyogan kadagiti nalawag nga ultraestruktural a panagbalbaliw ti mitochondrial. Dagiti mitochondrial a gunglo ket mabalin a makita kadagiti bagi ti selula ken dagiti dendritiko a kayo dagiti Mfn2cKO PN nga agtawen iti 5 ken 8 a lawas, ken ti akin-uneg nga estruktura ti membrane ket nagdalan kadagiti nauneg a panagbalbaliw (Pigura S4, A ken B). Maitunos kadagitoy nga ultraestruktural a panagbalbaliw ken ti maysa a dakkel a panagbaba ti mtDNA, ti panaganalisar kadagiti natadem a cerebral a cerebellar a ngilaw nga addaan iti tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ket nangipakita a ti mitochondrial a membrane a potensial kadagiti Mfn2cKO PN ket nangruna a bimmaba (Pigura S4C).
(A) Panag-analisar ti kurso ti panawen ti lebel ti panagiyebkas ti OXPHOS complex. Ibilang laeng dagiti protina nga addaan iti P<0.05 iti 8 a lawas (dua-a-dalan nga ANOVA). Dotted line: Awan ti panagbalbaliw no idilig iti CTRL. (B) Kannigid: Maysa a pagarigan ti cerebellar section a naimarka iti anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). Ti lugar nga okupado dagiti bagi ti selula ti Purkinje ket naabbungotan iti duyaw. Kannawan: Panagkuantipika kadagiti lebel ti MTCO1 (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance; n = 7 aginggana ti 20 a selula a naanalisar manipud iti tallo a tukak). (C) qPCR a panaganalisar ti numero ti kopia ti mtDNA iti naurnos a PN (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance; n = 3 aginggana iti 7 a tukak). (D) Kannigid: Maysa a pagarigan ti cerebellar slice a naimarka iti anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). Ti lugar nga okupado dagiti bagi ti selula ti Purkinje ket naabbungotan iti duyaw. Kannawan: Panagkuantipika kadagiti sugat ti mtDNA (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance; n = 5 aginggana ti 9 a selula manipud iti tallo a mice). (E) Maysa a pagarigan ti natadem a paset ti cerebellar a mangipakpakita kadagiti selula ti mitoYFP + Purkinje (pana) iti sibubukel a selula a patch clamp recording. (F) Panangkuantipikar iti IV curve. (G) Dagiti pannakabagi a rekording ti depolarizing current injection kadagiti selula ti CTRL ken Mfn2cKO Purkinje. Top trace: Ti umuna a pulso a nangtignay iti AP. Iti baba a pagsurotan: Maximum nga AP frequency. (H) Panagkuantipika kadagiti postsinaptiko nga espontaneo nga input (sPSPs). Ti pannakabagi a pagsurotan ti panagrekord ken ti zoom rationa ket naipakita iti (I). Ti maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance ket naanalisar ti n = 5 aginggana ti 20 a selula manipud kadagiti tallo a tukak. Dagiti datos ket naiyebkas a kas ti kaatiddogan±SEM; *P <0.05 nga; **P <0.01 nga; ***P <0.001 nga. (J) Dagiti pannakabagi a pagsurotan ti espontaneo nga AP a nairekord babaen ti panangusar iti perforated patch clamp mode. Nangato a pagsurotan: Maximum nga AP frequency. Bottom trace: zoom ti maymaysa nga AP. (K) Kuantipikar ti promedio ken maximum nga AP frequency segun iti (J). Panangsubok ni Mann-Whitney; n = 5 a selula ti naanalisar manipud iti uppat a tukak. Dagiti datos ket naiyebkas a kas ti kaatiddogan±SEM; saan a napateg.
Naduktalan ti nalawag a pannakadadael ti OXPHOS iti 8-lawas a Mfn2cKO PN, a mangipakpakita a ti pisiolohikal a panagandar dagiti neuron ket nakaro nga abnormal. Gapuna, inanalisarmi dagiti pasibo nga elektrikal a kababalin dagiti OXPHOS-a-kurang a neuron iti 4 agingga iti 5 a lawas ken 7 agingga iti 8 a lawas babaen ti panangaramid kadagiti sibubukel-selula a patch clamp recordings kadagiti natadem a cerebellar slices (Pigura 2E). Di ninamnama, ti promedio a potensial ti panaginana a membrane ken ti panagandur ti input dagiti neuron ti Mfn2cKO ket kapada ti kontrol, nupay adda dagiti di madmadlaw a panagdumaduma iti nagbaetan dagiti selula ( Tabla 1 ). Kasta met, iti 4 agingga iti 5 a lawas ti edad, awan ti nasarakan a dakkel a panagbalbaliw iti relasion ti agdama-boltahe (IV curve) (Pigura 2F). Nupay kasta, awan dagiti Mfn2cKO a neuron nga agtawen iti 7 agingga iti 8 a lawas ti nakalasat iti IV a rehimen (addang ti hyperpolarization), a mangipakpakita nga adda ti nalawag a sensibilidad iti potensial ti hyperpolarization iti daytoy a naladaw a tukad. Iti kasumbangirna, kadagiti neuron ti Mfn2cKO, dagiti depolarizing nga agos a mangpataud kadagiti maulit-ulit nga aksyon a potensial (AP) a panagruar ket nasayaat a naanus, a mangipakpakita a dagiti sapasap a padron ti panagiparuarda ket saan a naisangsangayan a naiduma manipud kadagiti 8-lawas a kontrol a neuron ( Tabla 1 ken Figura 2G ). Kasta met, ti kasansan ken amplitudo dagiti spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) ket maipada kadagidiay ti kontrol a grupo, ken ti kasansan dagiti pasamak ket ngimmato manipud iti 4 a lawas aginggana iti 5 a lawas aginggana iti 7 a lawas aginggana iti 8 a lawas nga addaan iti kapada a panagngato (Pigura 2, H ken I). Ti panawen ti sinaptiko a panagmataengan kadagiti PN ( 25 ). Kasta met laeng ti resulta a nagun-od kalpasan dagiti perforated PNs patches. Daytoy a konfigurasion ket manglapped ti mabalin a kompensasion dagiti depekto ti selula nga ATP, a kas mabalin a mapasamak iti panagirekord ti sibubukel a selula a patch clamp. Iti partikular, ti potensial ti panaginana a membrane ken ti espontaneo a frekuensia ti panagpaputok dagiti neuron ti Mfn2cKO ket saan a naapektaran ( Figura 2 , J ken K ). Iti pakagupgopan, dagitoy a resulta ket mangipakita a dagiti PN nga addaan iti nalawag nga OXPHOS a disfunsion ket makabael a mangsango kadagiti nangato a frekuensia a padron ti panagiparuar, a mangipakpakita nga adda ti mekanismo ti kompensasion a mangipalubos kadakuada a mangtaginayon kadagiti asideg-a-gagangay nga elektropisiolohiko a sungbat.
Dagiti datos ket naiyebkas a kas ti kaatiddogan ± SEM (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variansia, ti adu a panagidilig a panagsubok ni Holm-Sidak; *P<0.05). Ti numero ti yunit ket naipamatmat babaen kadagiti bracket.
Inkeddengmi a sukimaten no ti ania man a kategoria iti proteomics dataset (Pigura 1G) ket mangiraman kadagiti dalan a mabalin a mangkontra iti nakaro a kinakurang ti OXPHOS, iti kasta ket mangilawlawag no apay a ti naapektaran a PN ket mabalinna a mataginayon ti asideg-a-gagangay nga elektropisiolohia (Pigura 2, E aginggana iti K). . Impakita ti panaganalisar ti proteomika a dagiti enzyme a mairaman iti katabolismo dagiti sanga a kadena nga amino asido (BCAA) ket nangruna nga up-regulated (Pigura 3A ken Figura S5A), ken ti maudi a produkto nga acetyl-CoA (CoA) wenno succinyl CoA ket mabalin a mangnayon kadagiti trikarboksilato iti siklo ti arteriosclerosis Acid (TCA). Natakuatanmi nga agpada nga immadu ti linaon ti BCAA transaminase 1 (BCAT1) ken BCAT2. Dagitoy ket mangpataud ti umuna nga addang ti BCAA a katabolismo babaen ti panagpataud ti glutamate manipud iti α-ketoglutarate ( 26 ). Amin dagiti subunit a mangbukel ti sanga a kadena a keto acid dehydrogenase (BCKD) a komplikado ket upregulated (ti komplikado ket mangpataud ti sumaganad ken saan a mabaliwan a dekarboksilasion ti nagbanagan nga iskeleton ti karbon ti BCAA) (Pigura 3A ken Ladawan S5A). Nupay kasta, awan dagiti nalawag a panagbalbaliw iti BCAA a mismo a nasarakan iti naurnos a PN, a mabalin a gapu iti immadu a selula a panagala kadagitoy a nasken nga amino asido wenno ti panagusar kadagiti sabali a taudan (glukosa wenno lactic acid) tapno mangnayon iti siklo ti TCA (Pigura S5B). Dagiti PN nga awanan iti OXPHOS ket nangipakita pay ti immadu a panagrunaw ti glutamina ken dagiti aktibidad ti transamination iti 8 a lawas ti edad, a mabalin a maiparangarang babaen ti up-regulation dagiti mitochondrial nga enzyme a glutaminase (GLS) ken glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Pigura 3, A ken C). Maipalagip a ti up-regulation ti GLS ket limitado iti spliced ​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (ti panagbalbaliw ti Mfn2cKO/CTRL ket agarup a 4.5-a-mamin-adu, P = 0.05), ken ti espesipiko nga up-regulation na kadagiti tisyu ti kanser Mabalin a suportaran ti mitochondrial bioenergy. (27) nga.
(A) Ti mapa ti pudot ket mangipakita ti panagbalbaliw ti fold ti lebel ti protina para iti naikeddeng a ruta iti 8 a lawas. (B) Pagarigan ti cerebellar slice a naimarka iti anti-PCx antibody (scale bar, 20 μm). Ti duyaw a pana ket mangitudo iti bagi ti selula ti Purkinje. (C) Panag-analisar ti panagiyebkas ti protina ti kurso ti panawen a nailasin a kas napateg a kandidato para iti atherosclerosis (adu a t-panangsubok, *FDR <5%; n = 3-5 a tukak). (D) Iti ngato: Maysa nga eskematiko a diagrama a mangipakpakita kadagiti nadumaduma a wagas ti iseserrek iti naimarka a karbon a linaon ti [1-13C]pyruvate tracer (kayatna a sawen, babaen ti PDH wenno trans-arterial a ruta). Iti baba: Ti tsart ti biolin ket mangipakita ti porsiento ti single-labeled carbon (M1) a nakomberte iti aspartic acid, citric acid ken malic acid kalpasan ti panangimarkada kadagiti acute cerebellar slices babaen ti [1-13C]pyruvate (paired t-test; ** P <0.01). (E) Komprehensibo a panaganalisar ti pakasaritaan ti panawen ti naipasimudaag a dalan. Ibilang laeng dagiti protina nga addaan iti P<0.05 iti 8 a lawas . Dashed line: awan ti pateg ti panagbalbaliw (dua-a-dalan a panaganalisar ti variance; * P <0.05; *** P <0.001). Dagiti datos ket naiyebkas a kas ti mean±SEM.
Iti panaganalisarmi, ti BCAA a katabolismo ket nagbalin a maysa kadagiti kangrunaan nga up-regulation a dalan. Daytoy a kinapudno ket napigsa a mangisingasing a ti tomo ti bentilasion a sumrek iti siklo ti TCA ket mabalin a mabaliwan iti PN nga awanan iti OXPHOS. Daytoy ket mabalin a mangibagi ti maysa a nangruna a porma ti neuronal a metaboliko a panagkabel, a mabalin nga addaan iti direkta nga epekto iti neuronal a pisiolohia ken panagbiag bayat ti pannakamantener ti nakaro nga OXPHOS a disfunsion. Maitunos iti daytoy a hipotesis, nasarakanmi a ti kangrunaan nga anti-atherosclerotic enzyme PCx ket up-regulated (Mfn2cKO/CTRL agbaliw iti agarup a 1.5 a daras; Figura 3A), a mangpataud iti panagbalbaliw ti pyruvate iti oxaloacetate (28), a mapapati nga adda iti tisyu ti utek Ti ebkas iti ket nainget kadagiti astrocytes (29, 30). Maitunos kadagiti resulta ti proteomics, ti konfokal a mikroskopia ket nangipakita a ti PCx a panagiyebkas ket espesipiko ken nangruna a naingato kadagiti OXPHOS-a-kurang a PN, bayat a ti PCx a reaktibidad ket nangruna a nainget kadagiti kabangibang a Bergmann glial a selula ti kontrol (Pigura 3B). Tapno agtignay a masubok ti napaliiw nga upregulation ti PCx, inagasanmi dagiti natadem a cerebellar slices babaen ti [1-13C]pyruvate tracer. Idi ti pirubato ket na-oksida babaen ti pirubato dehidrogenase (PDH), ti etiketa ti isotopo na ket naungaw , Ngem naikabil kadagiti tengnga ti siklo ti TCA no ti pirubato ket na-metabolisado babaen dagiti vascular a reaksion (Pigura 3D). Iti panangsuporta iti datosmi iti proteomics, napaliiwmi ti dakkel a bilang dagiti marka manipud iti daytoy a tracer iti aspartic acid dagiti Mfn2cKO a ngilaw, bayat a ti citric acid ken malic acid ket addaan met iti kalalainganna nga uso, nupay saan a naipangpangruna (Pigura 3D).
Kadagiti dopamine a neuron dagiti MitoPark a tukak nga addaan iti mitochondrial a disfunsion a gapuanan babaen dagiti dopamine a neuron nga espesipiko a mangdadael iti mitochondrial transcription factor A gene (Tfam) (Pigura S6B), ti PCx nga ebkas ket nangruna met nga up-regulated (31), a mangipakpakita a ti acetone acid arteriosclerosis Ti panagpasamak ti sakit ket nairegulado bayat ti dysfunction ti neuronal OXPHOS iti bagi. Maipalagip a naduktalan a dagiti naisangayan nga enzyme (32-34) a mabalin a maiyebkas kadagiti neuron a mabalin a nainaig iti arteriosclerosis ket nangruna nga up-regulated kadagiti PN nga awanan iti OXPHOS, a kas ti propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), ti Malonyl-CoA ket mangbalbaliw ti propionyl-CoA iti succinyl-CoA ken mitochondrial malic enzyme 3 (ME3), . a ti kangrunaan nga akemna ket ti panangisubli iti pyruvate manipud iti malate (Pigura 3, A ken C) (33, 35). Mainayon pay, nasarakanmi ti dakkel a panagadu ti Pdk3 nga enzyme, a mangphosphorylate ken iti kasta ket mang-inactivate iti PDH ( 36 ), bayat nga awan ti naduktalan a panagbalbaliw iti Pdp1 nga enzyme a mangpaaktibo iti PDH wenno ti PDH enzyme complex a mismo ( Figura 3A ). Kanayon, kadagiti Mern2cKO PN, ti poporilasion ti α1 subunit α (PDHE1α) a subunit ti pyruvate dehydrogenase E1 a paset ti PDH a komplikado iti Ser293 (ammo a manglapped iti aktibidad ti enzyme ti PDH) ket naparang-ay ( Figura S6C) (Pigura S6C). Awan ti vascular access ti pyruvate.
Kamaudiananna, nasarakanmi a ti super dalan ti serine ken glycine biosynthesis, ti mainaig a mitochondrial folate (1C) a siklo ken proline biosynthesis (Pigura 1G ken Figura S5C) ket amin ket nangruna nga up-regulated, segun kadagiti reporta, bayat ti proseso ti panagpaaktibo. Dagiti tisyu iti aglawlaw ket mapaaktibo babaen ti mitochondrial dysfunction ( 5-7 ). Ti konfokal a panaganalisar a mangsuporta kadagitoy a datos ti proteomics ket nangipakita nga iti PN nga addaan iti OXPHOS a awan, dagiti cerebellar a ngilaw dagiti 8-lawas nga edad a tukak ket naipasidong iti serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), ti maysa a kangrunaan nga enzyme ti siklo ti mitochondrial folate. Napateg a sungbat ti immune (Pigura S5D). Iti 13 a CU-glucose-incubated acute cerebellar slices, dagiti metaboliko a panagsurot nga eksperimento ket ad-adda a nangpasingked ti up-regulation ti serine ken proline biosynthesis, a mangipakpakita a ti panagayus dagiti isoporma ti karbon iti serine ken proline ket immadu (Pigura S5E). Gapu ta dagiti reaksion nga intandudo babaen ti GLS ken GPT2 ket responsable iti sintesis ti glutamato manipud iti glutamina ken ti transamination iti nagbaetan ti glutamate ken α-ketoglutarate, ti upregulation-da ket mangipakita a dagiti OXPHOS-a-kurang a neuron ket addaan iti immadu a panagkasapulan para iti glutamate , Daytoy ket mabalin a naipangpangruna a mangtaginayon ti immadu a biosintesis ti prolina (Pigura S5C). Iti kasumbangir dagitoy a panagbalbaliw, ti proteomiko a panaganalisar kadagiti cerebellar nga astrosito manipud kadagiti PN-espesipiko a Mfn2cKO a tukak ket nangipakita a dagitoy a dalan (a mairaman dagiti amin nga antiperoxidases) ket saan a nagbalbaliw a nangruna iti panagiyebkas, isu a mangipakpakita Daytoy a metaboliko a panagiturong manen ket mapili kadagiti nadadael a PN ( Fig. S6 , D aginggana ti G ).
Iti pakagupgopan, dagitoy nga analisar ket nangipalgak kadagiti naipangpangruna a naidumaduma a padron ti temporal a panagpaaktibo dagiti espesipiko a metaboliko a dalan kadagiti PN. Urayno ti abnormal a neuronal a panagandar ti mitochondrial ket mabalin a mangiturong iti nasapa nga atherosclerosis ken 1C remodeling (Pigura 3E ken Figura S5C), ken uray pay dagiti maipadto a panagbalbaliw iti panagiyebkas kadagiti I ken IV a komplikado, dagiti panagbalbaliw iti serine de novo a sintesis ket laeng Daytoy ket nagbalin laeng a nalawag kadagiti naladaw a tukad. OXPHOS dysfunction (Pigura 3E ken Ladawan S5C). Dagitoy a naduktalan ket mangikeddeng ti agsasaruno a proseso a ti stress-a naiduron a mitochondrial (1C a siklo) ken sitoplasmiko (serine biosynthesis) ket sungbat a sinergistiko iti panagadu ti atherosclerosis iti siklo ti TCA tapno mangporma manen ti neuronal a metabolismo.
Dagiti 8-lawas nga OXPHOS-a-kurang a PN ket mabalinda a taginayonen ti nangato a frekuensia nga aktibidad ti panagpukaw ken agpasar iti naipangpangruna a metaboliko a panagkonekta manen tapno mabayadan ti mitochondrial a disfunsion. Daytoy a pannakatakuat ket mangpataud iti makapainteres a posibilidad nga uray iti daytoy a kanito, dagitoy a selula ket mabalin met nga Umawat iti therapeutic intervention tapno maitantan wenno malapdan ti neurodegeneration. Naladaw. Narisutmi daytoy a posibilidad babaen ti dua nga agwaywayas a panangibabaet. Iti umuna a pamay-an, nagdiseniokami iti Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) vector tapno ti MFN2 ket mabalin a mapili a maiyebkas kadagiti OXPHOS-a-kurang a PN iti vivo (Pigura S7A). Ti AAV a mangikodigo ti MFN2 ken ti fluorescent reporter gene a mCherry (Mfn2-AAV) ket naberipika kadagiti kangrunaan a kultura ti neuron iti in vitro, a nakaigapuan ti pannakaiyebkas ti MFN2 iti Cre-a nakadepende a wagas ken nangisalakan ti morpolohia ti mitochondrial, iti kasta ket nanglapped ti neuromutation kadagiti neuron ti Mfn2cKO ( Figura S7, B, D ken E ). Sumaganad, inaramidmi dagiti in vivo nga eksperimento tapno stereotactically a mangitulod iti 8-lawas nga Mfn2-AAV iti cerebellar cortex dagiti Mfn2cKO ken kontrol a tukak, ken inanalisarmi dagiti 12-lawas nga edad a tukak ( Figura 4A ). Dagiti naagasan a Mfn2cKO a tukak ket natay ( Figura 1 , A ken B ) ( 16 ). Ti viral a transduksion iti vivo ket nagresulta iti mapili a panagiyebkas ti PN kadagiti sumagmamano a sirkulo ti cerebellar (Pigura S7, G ken H). Ti panangineksion ti kontrol nga AAV a mangipakpakita laeng iti mCherry (Ctrl-AAV) ket awan ti dakkel nga epektona iti degree ti neurodegeneration kadagiti ayup ti Mfn2cKO. Iti kasumbangirna, ti panaganalisar kadagiti Mfn2cKO a naitransduced babaen ti Mfn2-AAV ket nangipakita ti maysa a naipangpangruna a mangsalaknib nga epekto ti PN a selula a suson ( Figura 4 , B ken C ). Nangnangruna, ti densidad ti neuron ket kasla gistay saan a mailasin manipud kadagiti kontrol nga ayup (Pigura 4, B ken C, ken Ladawan S7, H ken I). Ti panagiyebkas ti MFN1 ngem saan nga MFN2 ket agpapada nga epektibo iti panangisalakan ti ipapatay ti neuron (Pigura 4C ken Ladawan S7, C ken F), a mangipakpakita a ti panagiyebkas ti ectopic nga MFN1 ket epektibo a mabalin a mangnayon ti kaawan ti MFN2. Ti kanayonan a panaganalisar iti maymaysa a lebel ti PN ket nangipakita a ti Mfn2-AAV ket kaaduan a nangisalakan ti ultraestruktura ti mitochondria, nangnormalisar kadagiti lebel ti mtDNA, ken nangbaliktad ti nangato a panagiyebkas ti anti-angiogenesis a markador a PCx (Pigura 4, C aginggana ti E ). Ti biswal a panangsukimat kadagiti naisalakan a Mfn2cKO a tukak iti kasasaad ti panaginana ket nangipakita a ti postura ken dagiti sintoma ti motorda (panaggaraw S1 agingga iti S3) ket simmayaat. Iti konklusion, dagitoy nga eksperimento ket mangipakita a ti nataktak a pannakaipauneg manen ti MFN2 kadagiti PN a nakaro a kurang iti OXPHOS ket umdasen a mangbaliktad ti panagusar ti mtDNA ken mangtignay ti atherosclerosis, iti kasta ket manglapped ti panagrupsa ti axon ken ti ipapatay ti neuron iti vivo.
(A) Maysa nga eskema a mangipakpakita ti eksperimental nga eskediul para iti panangineksion iti AAV a mangikodigo iti MFN2 no ti naiparang a metaboliko a dalan ket naaktibo. (B) Dagiti pannakabagi a confocal a ladawan dagiti 12-lawas a cerebellar slices a naitransduce iti 8 a lawas kadagiti Mfn2cKO a tukak ken naimarka iti anti-Calbindin antibody. Kannawan: Panag-scale dagiti lanot ti axon. Ti sukog ti axon zoom ket 450 ken 75 μm. (C) Kannigid: Kuantipikasion ti densidad ti selula ti Purkinje iti AAV transduction loop (AAV+) (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance; n = 3 a tukak). Kannawan: mtDNA focus analysis iti transduced PN iti lawas 12 (unpaired t-test; n = 6 a selula manipud iti tallo a tukak). * P <0.05 nga; ** P <0.01 nga . (D) Dagiti pannakabagi a transmision nga elektron a mikrograpo dagiti PN dagiti Mfn2cKO a cerebellar a paset a naitransduce babaen dagiti naiparang a viral a vektor. Ti de rosas a maskara ket mangiladawan ti lugar nga okupado dagiti dendrite, ken ti duyaw a tulnek a kuadrado ket mangiladawan ti zoom a naited iti kannawan; n irepresentarna ti nukleo. Bar ti timbangan, 1μm. (E) ipakitana ti pagarigan ti PCx staining iti PN a naitransduced iti 12 a lawas. Bar ti timbangan, 20μm. OE, nalabes a panangiyebkas; FC, panagbalbaliw ti fold.
Kamaudiananna, sinukimatmi ti kinapateg ti peroxidase-induced cell survival kadagiti PN a nakapadas iti OXPHOS dysfunction. Napataudmi ti mCherry a mangikodigo iti AAV-shRNA (ababa a hairpin RNA) nga espesipiko a mangpuntiria iti mouse PCx mRNA (AAV-shPCx), ken in-inject ti virus wenno ti scrambled control-na (AAV-scr) iti cerebellum dagiti Mfn2cKO a tukak. Ti ineksion ket naaramid iti maikapat a lawas ti edad (Pigura 5A) tapno magun-od ti epektibo a PCx knockdown bayat ti panawen a ti PCx nga ebkas ket immadu (Pigura 3C) ken ti PN a selula a suson ket saan pay a nadadael (Pigura 1A). Maipalagip a ti panangtukkol iti PCx (Pigura S8A) ket mangiturong iti dakkel a panagpapardas ti ipapatay ti PN, a limitado iti naimpektaran a singsing (Pigura 5, B ken C). Tapno maawatan ti mekanismo dagiti metaboliko nga epekto a naiduron babaen ti PCx up-regulation, inadalmi ti redox a kasasaad dagiti PN kalpasan ti PCx knockdown ken AAV-a naipamaysa nga optical biosensor Grx1-roGFP2 ket aggigiddan a naiyebkas (Pigura S8, B aginggana iti D) tapno matingiting ti glutathione Ti relatibo a panagbalbaliw ti peptide redox a potensial (38). Kalpasanna, inaramidmi ti dua-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) kadagiti natadem a tedted ti utek dagiti 7-lawas nga Mfn2cKO wenno kontrol a littermates tapno mailasin dagiti potensial a panagbalbaliw iti kasasaad ti cytoplasmic redox kalpasan ti panangpaneknek kadagiti kasasaad ti FLIM (Pigura S8, E agingga iti G). Ti panaganalisar ket nangipakita ti dakkel a panagadu ti kasasaad ti oksidasion ti maymaysa nga Mfn2cKO PN nga awanan iti PCx nga ebkas, a naiduma manipud kadagiti kontrol a neuron wenno dagiti Mfn2cKO PN a mangiyebkas laeng iti scrambled shRNA ( Figura 5 , D ken E ). Idi ti PCx nga ebkas ket na-down-regulated, ti porsiento dagiti Mfn2cKO PN a mangipakpakita ti nangato nga oksidado a kasasaad ket immadu iti nasurok a mamitlo (Pigura 5E), a mangipakpakita a ti PCx nga up-regulation ket nagtalinaed ti redox a kapasidad dagiti nadadael a neuron.
(A) Maysa nga eskema a mangipakpakita ti eksperimental nga eskediul para iti panangineksion iti AAV a mangikodigo iti shPCx no ti naiparang a metaboliko a dalan ket naaktibo. (B) Dagiti pannakabagi a confocal a retrato dagiti 8-lawas a cerebellar sections kadagiti Mfn2cKO a tukak a naitransduced ken naimarka iti anti-calcineurin antibody iti 4 a lawas. Bar ti timbangan, 450μm. (C) Panagkuantipika ti densidad ti selula ti Purkinje kadagiti AAV-a naitransduced a lubong (maysa-a-dalan a panaganalisar ti variance; n = 3 aginggana ti 4 a tukak). Dagiti datos ket naiyebkas a kas ti kaatiddogan±SEM; ***P <0.001 nga. (D) Ti pannakabagi a ladawan ti FLIM ket mangipakita ti promedio a panagbiag ti 7-lawas a PN a mangipakpakita ti glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 iti sidong dagiti naikeddeng nga eksperimental a kasasaad. LUT (look-up table) ratio: aggigiddan ti oras ti panagbiag (kadagiti pikosegundos). Bar ti timbangan, 25μm. (E) Ti histogram ket mangipakita ti pannakaiwaras dagiti Grx1-roGFP2 a pateg ti panagbiag manipud iti (D) (n=158 aginggana iti 368 a selula iti dua a tukak iti sidong ti tunggal maysa a kasasaad). Ti pie chart iti ngato ti tunggal maysa a histogram: ket mangipakita ti bilang dagiti selula nga addaan kadagiti signipikante nga at-atiddog ​​(nalabaga, na-oxidized) wenno ab-ababa (asul, naikkat) a pateg ti panagbiag, a lumablabas iti 1 SD ti promedio a pateg ti panagbiag iti CTRL-AAV-scr. (F) Ti naisingasing a modelo ket mangipakita ti mangsalaknib nga epekto ti upregulation ti neuronal PCx.
Amin iti amin, ti datos nga ipaaymi ditoy ket mangipakita a ti panagiyebkas manen ti MFN2 ket naan-anay a makaispal iti narang-ay a PN nga addaan iti nakaro a panagkurang ti OXPHOS, nakaro a pannakakissay ti mtDNA, ken nalabes nga abnormal a kasla ista a morpolohia, iti kasta ket mangipaay iti agtultuloy a panagrang-ay uray kadagiti narang-ay a sakit. Ti neurodegeneration mangipaay iti mabaliwan nga ebidensia ti tukad sakbay ti ipapatay ti selula. Daytoy a tukad ti metaboliko a kinalukneng ket ad-adda a naipaganetget babaen ti abilidad dagiti neuron a mangtignay ti atherosclerosis (maysa a panag-rewiring ti siklo ti TCA), a manglapped ti PCx a panagiyebkas kadagiti PN nga awanan iti OXPHOS ken mangpasayaat ti ipapatay ti selula, iti kasta ket addaan iti mangsalaknib nga akem (Pigura 5F).
Iti daytoy a panagadal, nangitedkami iti ebidensia a ti sungbat dagiti PN iti OXPHOS a disfunsion ket in-inut nga agtitipon iti TCA a siklo nga atherosclerosis babaen ti naidumaduma a dalan ti panagpaaktibo a naaktibo babaen dagiti metaboliko a programa. Pinasingkedanmi ti proteomiko a panaganalisar babaen dagiti adu a komplementario a pamay-an ken impalgak a no makarit babaen ti nakaro a mitochondrial a disfunsion, dagiti neuron ket addaan iti dati a di ammo a porma ti metaboliko nga elastisidad. Iti pannakasdaawmi, ti intero a proseso ti panag-rewiring ket saan a nasken a mangmarka ti terminal a metaboliko a kasasaad a kakuykuyog ti neurodegeneration nga in-inut ken saan a mabaliwan, ngem ti datosmi ket mangisingasing a daytoy ket mabalin a mangbukel ti maysa a maintenance neuron urayno iti tukad sakbay ti ipapatay ti selula Functional compensation mechanism. Ipamatmat daytoy a natakuatan a dagiti neuron ket addaan iti dakkel a tukad ti metaboliko a plastikidad iti bagi. Daytoy a kinapudno ket mangpaneknek a ti naud-udi a pannakaipauneg manen ti MFN2 ket mabalin a mangbaliktad ti panagiyebkas kadagiti kangrunaan a metaboliko a markador ken manglapped ti panagdadael ti PN. Maisupadi ketdi, lapdanna ti atherosclerosis ken papartakenna dagiti nerbio. transseksual.
Maysa kadagiti makaawis unay a natakuatan iti panagsirarakmi ket dagiti PN nga awanan iti OXPHOS ket mabalinda a baliwan ti metabolismo ti siklo ti TCA babaen ti up-regulating enzymes nga espesipiko a mangtignay iti arteriosclerosis. Ti metaboliko a panagurnos manen ket maysa a gagangay a tampok dagiti selula ti kanser, a dagiti dadduma kadagitoy ket agpannurayda iti glutamina tapno mangnayon kadagiti TCA a siklo a nagbaetan tapno mangpataud kadagiti mangkissay a katupag, a mangiturong ti kadena ti panaganges ken mangmantener ti panagpataud kadagiti lipido ken nukleotido a biosintesis a prekursor (39 , 40). Impakita ti nabiit pay a panagadal nga kadagiti peripheral tissues a makapadas iti OXPHOS dysfunction, ti panagkonekta manen ti glutamine/glutamate metabolism ket maysa met a nalatak a tampok ( 5 , 41 ), a sadiay ti direksion ti iseserrek ti glutamine iti siklo ti TCA ket agpannuray Gapu iti kinakaro ti pannakadangran ti OXPHOS ( 41 ). ). Nupay kasta, awan ti nalawag nga ebidensia iti ania man a panagpapada ti neuronal a metaboliko a plastikidad iti bagi ken ti mabalin a pakainaiganna iti konteksto ti sakit. Iti nabiit pay nga in vitro a panagadal, dagiti kangrunaan a kortikal a neuron ket naipakita a mangtignay kadagiti glutamate pool para iti neurotransmision, iti kasta ket mangitandudo ti oksidatibo a metabolismo ken atherosclerosis iti sidong dagiti metaboliko a kasasaad ti stress ( 42 ). Maipalagip nga iti sidong ti parmakolohiko a pananglapped ti siklo ti TCA nga enzyme succinate dehydrogenase, ti pyruvate carboxylation ket mapapati a mangtaginayon ti sintesis ti oxaloacetate kadagiti kulturado a cerebellar granule neurons ( 34 ). Nupay kasta, ti pisiolohikal a pakainaigan dagitoy a mekanismo iti tisyu ti utek (a sadiay ti atherosclerosis ket mapapati a kangrunaan a naikeddeng kadagiti astrocyte) ket addaan pay laeng iti napateg a pisiolohikal a kaipapanan ( 43 ). Iti daytoy a kaso, ipakita ti datosmi a dagiti PN a nadadael babaen ti OXPHOS iti bagi ket mabalin a mabaliwan iti panagdadael ti BCAA ken pyruvate carboxylation, nga isuda ti dua a kangrunaan a taudan ti suplementasion dagiti TCA pool intermediates. Urayno ti maipagarup a kontribusion ti BCAA a katabolismo iti neuronal nga enerhia a metabolismo ket naisingasing, malaksid ti papel ti glutamate ken GABA para iti neurotransmision ( 44 ), awan pay laeng ti ebidensia para kadagitoy a mekanismo iti vivo. Gapuna, nalaka a pattapattaen a dagiti dysfunctional a PN ket automatiko a makabayad iti panagusar kadagiti TCA a nagbaetan a tinignay babaen ti proseso ti asimilasion babaen ti panangpaadu ti atherosclerosis. Iti partikular, ti upregulation ti PCx ket mabalin a kasapulan tapno mataginayon ti immadu a panagkasapulan para iti aspartic acid, a naisingasing kadagiti umad-adu a selula nga addaan iti mitochondrial dysfunction ( 45 ). Nupay kasta, ti panaganalisar ti metabolomikami ket saan a nangipalgak ti ania man a naipangpangruna a panagbalbaliw iti natalged-a-kasasaad a lebel ti aspartiko nga asido kadagiti Mfn2cKO PN (Pigura S6A), a maipagarup a mangipakita ti nadumaduma a metaboliko a panagusar ti aspartiko nga asido iti nagbaetan dagiti umad-adu a selula ken dagiti kalpasan ti mitotiko a neuron . Urayno ti eksakto a mekanismo ti PCx upregulation kadagiti dysfunctional a neuron iti vivo ket agtaltalinaed a mailasin, impakitami a daytoy a nasapa a sungbat ket addaan iti napateg nga akem iti panangtaginayon ti redox a kasasaad dagiti neuron, a naipakita kadagiti eksperimento ti FLIM kadagiti cerebellar a ngilaw. Iti partikular, ti pananglapped kadagiti PN manipud iti up-regulating PCx ket mabalin a mangiturong iti ad-adu nga oxidized a kasasaad ken mangpapartak iti ipapatay ti selula. Ti pannakapaaktibo ti panagdadael ti BCAA ken ti karboksilasion ti pirubato ket saan a wagas a mangilasin kadagiti peripheral a tisyu ti mitochondrial a disfunsion ( 7 ). Gapuna, kasla dagitoy ti prioridad a tampok dagiti neuron nga awanan iti OXPHOS, uray no saan laeng a ti tampok, a napateg para iti neurodegeneration. .
Ti sakit ti cerebellar ket maysa a heterogeneous a kita ti neurodegenerative disease a kadawyan a maiparangarang a kas ataxia ken masansan a mangdadael kadagiti PN ( 46 ). Daytoy a populasion ti neuron ket nangruna a nalaka a maapektaran iti mitochondrial a disfunsion gapu ta ti mapili a panagrupsada kadagiti utot ket umdasen a mangpataud manen kadagiti adu kadagiti motor a sintoma a mangilasin ti tao nga spinocerebellar ataxia ( 16 , 47 , 48 ). Segun kadagiti report, ti transgenic a modelo ti ipus nga addaan iti mutant gene ket nainaig iti human spinocerebellar ataxia ken addaan iti mitochondrial dysfunction ( 49 , 50 ), a mangipaganetget iti kinapateg ti panagadal kadagiti pagbanagan ti OXPHOS deficiency iti PNPH. Gapuna, nangnangruna a maibagay dayta nga epektibo a mangisina ken mangadal iti daytoy naisangsangayan a populasion dagiti neuron. Nupay kasta, gapu ta dagiti PN ket sensitibo unay iti presion ken mangbukel ti nababa a paset ti sibubukel a populasion ti selula ti cerebellar, para kadagiti adu a panagadal a naibatay iti omics, ti mapili a panagsisina kadagitoy a kas dagiti sibubukel a selula ket maysa pay laeng a makakarit nga aspeto. Nupay dandani imposible a maragpat ti naan-anay a kinakurang ti kontaminasion dagiti dadduma a kita ti selula (nangruna dagiti nataengan a tisyu), pinagtiponmi ti epektibo nga addang ti panagsisina iti FACS tapno makagun-od iti umdas a bilang dagiti agbiag a neuron para iti panaganalisar iti baba ti ayus a proteomics, ken addaan iti Medyo nangato a sakup ti protina (agarup a 3000 a protina) no idilig iti addan a data set ti sibubukel a cerebellum (51). Babaen ti panangpreserba ti panagbiag dagiti sibubukel a selula, ti pamay-an nga ipaaymi ditoy ket mangipalubos kadakami a saan laeng a mangsukimat kadagiti panagbalbaliw kadagiti metaboliko a dalan kadagiti mitochondria, ngem pay a mangsukimat kadagiti panagbalbaliw kadagiti cytoplasmic a katupagna, a mangkomplemento ti panagusar kadagiti mitochondrial a membrane tags tapno mangpabaknang iti kita ti selula Ti baro a pamay-an para iti bilang dagiti mitochondria kadagiti komplikado a tisyu (52, 53). Ti pamay-an nga iladawanmi ket saan laeng a mainaig iti panagadal kadagiti selula ti Purkinje, ngem nalaka a mayaplikar iti ania man a kita ti selula tapno tamingen dagiti metaboliko a panagbalbaliw kadagiti masakit nga utek, a mairaman dagiti dadduma pay a modelo ti mitochondrial dysfunction.
Kamaudiananna, nailasinmi ti maysa a tawa ti panangagas bayat daytoy a proseso ti metaboliko a panagurnos manen a mabalin a naan-anay a mangbaliw kadagiti kangrunaan a pagilasinan ti selula a panagbannog ken manglapped iti panagrupsa ti neuron. Gapuna, ti pannakaawat kadagiti panagandar nga implikasionda ti panag-rewiring a nailadawan ditoy ket mabalin a mangipaay kadagiti batayan a pannakaammo kadagiti mabalin a panangagas para iti panangtaginayon ti neuronal a panagbiag bayat ti mitochondrial a disfunsion. Kasapulan ti masanguanan a panagsirarak a nairanta a mangpisipisi kadagiti panagbalbaliw iti metabolismo ti enerhia kadagiti dadduma a kita ti selula ti utek tapno naan-anay a maipalgak ti pannakayaplikar daytoy a prinsipio kadagiti dadduma a sakit ti neurolohikal.
Dagiti MitoPark a tukak ket nailadawan iti napalabas ( 31 ). Dagiti C57BL/6N a tukak nga addaan kadagiti loxP a flanking Mfn2 a gene ket nailadawan iti napalabas ( 18 ) ken naiballasiw kadagiti L7-Cre a tukak ( 23 ). Kalpasanna dagiti nagbanagan a doble a heterozigoto a kaputotan ket naiballasiw kadagiti homozigoto a Mfn2loxP/Mfn2loxP a tukak tapno mangpataud kadagiti Purkinje-espesipiko a gene a knockout para iti Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Iti maysa a subgrupo ti panagasawa, ti Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) ket naiyam-ammo babaen dagiti kanayonan a panagballasiw ( 20 ). Amin a pamay-an ti animal ket naaramid a maitunos kadagiti pagannurotan ti Europa, nasional ken institusional ken inaprobaran ti LandesamtfürNatur ti Umwelt ken Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemania. Ti trabaho kadagiti animal ket sumurot met iti panangiwanwan ti European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Kalpasan a ma-anesthetize ti cervical dislocation ti masikog a babai, maibukod ti embryo ti ipus (E13). Ti cortex ket na-dissect iti Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) a nainayon iti 10 mM Hepes ken naipasa iti Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium a naglaon iti papain (20 U/ml) ken cysteine ​​(1μg/ml). Ipaburek ti tisyu iti DMEM) ken isina babaen ti enzymatic digestion. Ml) iti 37°C iti 20 a minuto, ken kalpasanna mekanikal a nagiling iti DMEM a nainayon iti 10% a fetal bovine serum. Dagiti selula ket nabukel kadagiti sarming a coverslip a nakaluban iti polylysine iti densidad a 2×106 iti tunggal 6 cm a culture dish wenno iti densidad a 0.5×105 a selula/cm2 para iti panaganalisar iti imaging. Kalpasan ti 4 nga oras, ti medium ket nasukatan iti Neurobasal serum-free medium a naglaon iti 1% B27 a suplemento ken 0.5 mM GlutaMax. Kalpasanna dagiti neuron ket natengngel iti 37°C ken 5% CO2 iti intero nga eksperimento, ken nataraonan iti maminsan iti makalawas. Tapno matignay ti rekombinasion iti in vitro, ti 3μl (24-well culture dish) wenno 0.5μl (24-well plate) ti sumaganad nga AAV9 virus vector ket naus-usar a mangagas kadagiti neuron iti maikadua nga aldaw iti in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numero ti katalogo 105530-AAV9) ken AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numero ti katalogo 105545-AAV9).
Ti Mouse Mfn1 ken Mfn2 a komplementario a DNA (naala manipud iti Addgene plasmid #23212 ken #23213, agpada) ket namarkaan iti V5 a panagsasaruno (GKPIPNPLLGLDST) iti C-terminus, ken naitipon iti mCherry iti kuadro babaen ti T2A a panagsasaruno. Ti Grx1-roGFP2 ket sagut manipud kenni Heidelberg T. P. Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Babaen ti panangsukat ti tdTomato cassette babaen ti panagusar kadagiti gagangay a pamay-an ti panagklona, ​​ti cassette ket nasubklon iti pAAV-CAG-FLEX-tdTomato a duri (Addgene a reperensia a numero 28306) tapno mangpataud ti pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ken Dagiti vektor ti pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Ti umasping nga estratehia ket naus-usar a mangpataud ti kontrol a vektor a pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Tapno makapataud ti AAV-shPCx a konstrukto, ti plasmid nga AAV a vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ket kasapulan, a naglaon ti panagsasaruno ti DNA a mangikodigo ti shRNA a mangpuntiria ti PCx ti ipus (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) Iti sidong ti kontrol ti U6 promoter, mausar ti mCherry iti sidong ti kontrol ti CMV promoter. Ti panagpataud kadagiti katulongan nga AAV vector ket naaramid segun kadagiti instruksion ti agpatpataud (Cell Biolabs). Iti ababa a pannao, agusar ti panagiyakar a plasmid nga awit ti mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) nga apagbiit Transpeksion dagiti 293AAV a selula-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) wenno Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) a mangkodigo a gene, ken kasta met ti panagkodigo ti AAV1 a kapsid a protina ken aksesoria a protina Panagempake ti plasmid a plasmid, babaen ti panagusar ti pamay-an ti calcium phosphate. Ti krudo a virus supernatant ket naala babaen dagiti siklo ti freeze-thaw iti namaga a yelo/ethanol a pagdigusan ken dagiti lysed cells iti phosphate buffered saline (PBS). Ti AAV vector ket nadalus babaen ti discontinuous iodixanol gradient ultracentrifugation (24 nga oras iti 32,000 rpm ken 4°C) ken nakonsentrar babaen ti panagusar ti Amicon ultra-15 centrifugal filter. Ti genome titer ti AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kopia ti genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ket kas ti dati a nailadawan (54), narukod babaen ti aktual nga oras a kuantitatibo a PCR (qPCR) . -MFN1-V5 (1.9 × 1013 GC / ml) ken AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Dagiti kangrunaan a neuron ket nakiskis iti nalamiis a yelo a 1x PBS, na-pellet, ken kalpasanna na-homogenized iti 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer a naglaon iti phosphatase ken protease inhibitor (Roche). Ti panagkuantipika ti protina ket naaramid babaen ti panagusar ti bicinchoninic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Kalpasanna dagiti protina ket naisina babaen ti SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ken kalpasanna na-blot iti maysa a polyvinylidene fluoride membrane (GE Healthcare). I-block dagiti saan nga espesipiko a lugar ken i-incubate iti kangrunaan nga antibody (kitaen ti Table S1 para kadagiti detalye) iti 5% a gatas iti TBST (Tris-buffered saline with Tween), addang ti panagbuggo ken segundario nga antibody iti TBST Incubate. Ipaburek iti primary antibody iti maysa a rabii iti +4°C. Kalpasan ti panagbuggo, ipaap-ap ti segundario nga antibody iti 2 nga oras iti temperatura ti siled. Kalpasanna, babaen ti panangipapudot iti isu met laeng a blot iti anti-β-actin antibody, napasingkedan ti isu met laeng a panagkarga. Panangduktal babaen ti panagbalbaliw iti chemiluminescence ken panangpasayaat iti chemiluminescence (GE Healthcare).
Dagiti neuron a dati a naimula kadagiti sarming a coverslip ket naipatakder babaen ti 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS iti naikeddeng a punto ti panawen iti temperatura ti siled iti las-ud ti 10 a minuto. Dagiti coverslips ket umuna a mailaok iti 0.1% Triton X-100/PBS iti 5 a minuto iti temperatura ti siled, ken kalpasanna iti blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Iti maikadua nga aldaw, dagiti coverslips ket nabugguan babaen ti blocking buffer ken naipatakder iti maitutop a fluorophore-conjugated secondary antibody iti 2 nga oras iti temperatura ti siled; kamaudiananna, dagiti sample ket nabugguan a naimbag iti PBS babaen ti 4′,6-diamidino-2 -Ti Phenylindole (DAPI) ket na-counterstain ken kalpasanna naipatakder iti mikroskopio a slide babaen ti Aqua-Poly/Mount.
Dagiti utot (lalaki ken kabaian) ket na-anesthetize babaen ti intraperitoneal injection ti ketamine (130 mg/kg) ken xylazine (10 mg/kg) ken naipauneg iti subcutaneously iti carprofen analgesic (5 mg/kg) , Ket naikabil iti stereotactic instrument (Kopf) a naikkan iti nabara a pad. Ibutaktak ti kalasag ken agusar iti dental drill tapno naingpis ti paset ti cerebellar cortex a katupag ti mis bone (manipud lambda: ipus 1.8, lateral 1, katupag dagiti lobules IV ken V). Agusar iti kurbado a dagum ti herringbone tapno siaannad a mangpataud iti bassit nga abut iti kalasag tapno maliklikan ti pannakasinga ti vasculature iti baba. Kalpasanna ti naingpis a naidrowing a sarming a kapilaria ket in-inut a maikabil iti mikro-abut (manipud -1.3 agingga iti -1 iti bentral a sikigan ti dura mater), ken ti 200 agingga iti 300 nl nga AAV ket mai-inject iti micro-injector (Narishige) babaen kadagiti manual a herringbone (Narishige) iti sumagmamano a daras iti nababa a presion iti las-ud ti panawen a 10 agingga iti 20 a minuto a tawa. Kalpasan ti pannakaipauneg, ikabil ti capillary iti sabali pay a 10 a minuto tapno naan-anay nga agwaras ti virus. Kalpasan a maikkat dagiti kapilaria, madait a naimbag ti kudil tapno basbassit ti panaglammin ti sugat ken makaungar ti animal. Naagasan dagiti animal babaen kadagiti analgesic (caspofen) iti sumagmamano nga aldaw kalpasan ti operasion, a bayat dayta a tiempo namonitor a naimbag ti pisikal a kasasaadda ket kalpasanna na-euthanize-da iti naibaga a punto ti tiempo. Amin a pamay-an ket naaramid a maitunos kadagiti pagalagadan ti Europa, nailian ken institusional ken inaprobaran babaen ti LandesamtfürNatur ti Umwelt ken Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemania.
Dagiti ayup ket na-anesthetize babaen ti ketamine (100 mg/kg) ken xylazine (10 mg/kg), ken ti puso ket naperfuse iti 0.1 M PBS nga umuna, ken kalpasanna babaen ti 4% PFA iti PBS. Ti tisyu ket na-dissect ken naipatakder iti 4% PFA/PBS iti maysa a rabii iti 4°C. Ti agtayyek a kutsilio (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ket naus-usar a mangisagana kadagiti sagittal a paset (50 μm ti kapuskolna) manipud iti naipatakder nga utek iti PBS. Malaksid no naibaga ti sabali, ti panangmantsa kadagiti nawaya a lumlumned a paset ket naaramid kas nailadawan iti ngato (13) iti temperatura ti siled ken panaggudua. Iti ababa a pannao, umuna, dagiti nagun-od a ngilaw ket napermeabilize babaen ti 0.5% Triton X-100/PBS iti 15 a minuto iti temperatura ti siled; para kadagiti sumagmamano nga epitope (Pcx ken Shmt2), babaen ti in tris-EDTA buffer iti 80°C (PH 9) ipapudot dagiti ngilaw iti 25 a minuto imbes a daytoy nga addang. Sumaganad, dagiti paset ket naipatakder babaen ti kangrunaan nga antibody (kitaen ti Tabla S1) iti blocking buffer (3% BSA/PBS) iti 4°C iti maysa a rabii nga addaan iti panaggudua. Iti simmaganad nga aldaw, dagiti paset ket nabugguan babaen ti blocking buffer ken naipatakder babaen ti maitutop a fluorophore-conjugated a sekondario nga antibody iti 2 nga oras iti temperatura ti siled; kamaudiananna, dagiti paset ket nabugguan a naimbag iti PBS, nakontra-mantsa babaen ti DAPI, ken kalpasanna naipatakder babaen ti AquaPolymount Iti maysa a mikroskopio a slide.
Nausar ti laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X wenno TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) a naikkan iti puraw a lawag a laser ken 405 diode ultraviolet laser a nangiladawan iti sample. Babaen ti panangpukaw ti fluorophore ken panagurnong ti senial babaen ti Hybrid Detector (HyDs), ti software ti LAS-X ket naus-usar a mangurnong kadagiti naurnong a ladawan a maitunos iti Nyquist a panagsample iti agsasaruno a wagas: para kadagiti saan a kuantitatibo a panel, daytoy ket nangato a dinamiko a senial (kas pagarigan, kadagiti somatiko a selula ken dendrito) mtYFP) Usaren ti HyD tapno mailasin ti bilang dagiti PN iti BrightR a kasasaad). Ti gating manipud 0.3 agingga iti 6 ns ket maipakat tapno mapabassit ti background.
Real-time imaging dagiti naurnos a selula. Kalpasan ti panagurnos iti Neurobasal-A a medium a naglaon iti 1% B27 a suplemento ken 0.5 mM GlutaMax, dagiti selula ket dagus a nabukel kadagiti poly-l-lysine-coated glass slides (μ-Slide8 Well, Ibidi, numero ti katalogo 80826) , Ket kalpasanna, pagtalinaeden daytoy iti 37°C ken 5% CO2 iti 1 nga oras tapno agtalinaed dagiti selula. Ti aktual nga oras a panagimahe ket naaramid iti Leica SP8 laser scanning confocal microscope a naikkan iti puraw a laser, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens ken ti heating stage.
Ti ipus ket napardas a na-anesthetize babaen ti carbon dioxide ken naputolan ti ulo, ti utek ket napardas a naikkat manipud iti kalasag, ken naputed iti 200μm ti kapuskol (para iti 13C labeling experiment) wenno 275μm ti kapuskol (para iti dua nga eksperimento ti photon) a sagittal section a napno kadagiti sumaganad a material Ti sorbetes (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) . ket napno kadagiti sumaganad a substansia: 125 mM a nalamiis a yelo, napuskol iti karbon (95% O2 ken 5% CO2) a nababa a Ca2 + artipisial a pluido ti cerebrospinal (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.5 mM CaCl2 ken 3.5 mM MgCl2 (osmotiko a presion iti 310 aginggana iti 330 mmol). Iyalis dagiti nagun-od a tedted ti utek iti pre-incubation chamber nga addaan iti nangatngato a Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ken 2.0 mM MgCl2) Kalalainganna) pH 7.4 ken 310 agingga iti 320 mmol).
Bayat ti proseso ti panagimahe, dagiti ngilaw ket nayakar iti naisangsangayan a siled ti panagimahe, ken ti eksperimento ket naaramid iti sidong ti agtultuloy nga ACSF a panagperfusion iti agtultuloy a temperatura a 32° aginggana iti 33°C. Ti multiphoton laser scanning microscope (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) a naikkan iti Leica 25x objective lens (NA 0.95, danum), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) ket naus-usar para iti slice imaging. Modulo ti FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ti Grx1-roGFP2. Dagiti panagbalbaliw iti sitoplasmiko a redox a kasasaad dagiti PN ket narukod babaen ti dua-a-poton a FLIM kadagiti sagittal nga ngilaw ti utek, a sadiay ti Grx1-roGFP2 biosensor ket pinuntiria dagiti PN. Iti PN a sapasap, ti tay-ak ti panaggun-od ket napili iti agarup a 50 aginggana ti 80 μm iti baba ti rabaw ti slice tapno masigurado nga adda ti agbiag a PN (kayatna a sawen, ti kaawan ti nakuentas nga estruktura wenno dagiti neuronal a morpolohiko a panagbalbaliw iti igid dagiti dendrito) ken ti doble a positibo a roGFP2 a sensor ken ti AAV a mangikodigo ti shRNA PCx wenno ti panagsasaruno ti panagtengngelna (tunggal maysa a co-expressing mCherry). Mangurnong kadagiti single-stack a ladawan babaen ti 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 a piksel]. Panangduktal: ti akin-uneg a HyD, fluorescein isothiocyanate (FITC) filter group] ken ti panagpromedio ti ladawan iti uneg ti 2 aginggana ti 3 a minuto ket maus-usar tapno masigurado nga umdas dagiti poton ket maurnong (1000 a poton iti dagup) para iti panagikapet ti kurba. Ti sensibilidad ti Grx1-roGFP2 a proba ken ti panangipaneknek kadagiti kasasaad ti FLIM ket naaramid babaen ti panangmonitor ti pateg ti kapaut ti panagbiag ti roGFP2 no mainayon ti exogenous a 10 mM H2O2 iti perfusion ACSF (tapno mapaadu ti oksidasion, a mangibunga iti immadu a panagbiag), ken kalpasanna ti pananginayon iti 2 mM a dithiothreitol (mangkissay iti tukad ti pannakakissay, a mangibunga iti panagbaba iti kapaut ti panagbiag) (Pigura S8, D agingga iti G). Usaren ti FLIMfit 5.1.1 a software tapno analisaen dagiti nagun-od a resulta, maibagay ti maymaysa nga eksponensial a kurba ti panagrupsa ti sibubukel a ladawan iti nasukatan nga IRF (instrument response function), ken ti χ2 ket agarup a 1. Tapno makalkula ti panagbiag ti maymaysa a PN, ti maskara iti aglawlaw ti bagi ti nerbio ket manual a naidrowing, ken ti promedio a panagbiag iti tunggal maskara ket naus-usar para iti panagkuantipika.
Mitochondrial a potensial nga analisar. Kalpasan a ti natadem a paset ket naipatakder babaen ti 100 nM TMRM a direkta a nainayon iti naperfuse nga ACSF iti las-ud ti 30 a minuto, dagiti mitochondrial a potensial a panagbalbaliw dagiti PN ket narukod babaen ti dua-photon a mikroskopio. Ti TMRM a panagimahe ket naaramid babaen ti panagpukaw ti proba iti 920 nm ken panagusar ti akin-uneg a HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) tapno mangurnong kadagiti senial; babaen ti panagusar ti isu met laeng nga atiddog ​​ti allon ti panagpukaw ngem panagusar ti naiduma nga akin-uneg a HyD (FITC :525/50) tapno mangiladawan ti mtYFP. Usaren ti plug-in ti Image Calculator ti ImageJ tapno matingiting ti mitochondrial a potensial iti maymaysa a lebel ti selula. Iti ababa a pannao, ti plug-in nga ekuasion: senial = min (mtYFP, TMRM) ket naus-usar a mangilasin ti rehion ti mitochondrial a mangipakpakita ti senial ti TMRM iti Purkinje Somali iti maymaysa-a-tuon a konfokal a ladawan ti maitunos a kanal. Kalpasanna ti lugar ti pixel iti nagbanagan a maskara ket nakuantipikar, ken kalpasanna ket na-normalize iti maitunos a pagrukodan a maymaysa-a-tuon a ladawan ti kanal ti mtYFP tapno makagun-od ti mitochondrial a paset a mangipakpakita ti mitochondrial a potensial.
Na-deconvoluted ti ladawan babaen ti Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) software. Para kadagiti nai-scan a ladawan dagiti baldosa, ti montage ti maymaysa a baldosa ket naaramid babaen ti panagusar ti automatiko nga algorithm ti panagdait nga inted ti software ti LAS-X. Kalpasan ti image calibration, usaren ti ImageJ ken Adobe Photoshop tapno ad-adda a maproseso ti ladawan ken agpapada a maitunos ti kinaraniag ken panagduduma. Usaren ti Adobe Illustrator para iti panagsagana iti graphic.
panaganalisar ti pokus ti mtDNA. Ti bilang dagiti sugat ti mtDNA ket nakuantipikar kadagiti paset ti cerebellar a naimarka kadagiti antibody a maibusor iti DNA babaen ti confocal microscope. Tunggal target a lugar ket naparsua para iti bagi ti selula ken ti nukleo ti tunggal selula, ken ti bukod a lugar ket nakuenta babaen ti panagusar ti Multi Measure plug-in (ImageJ software). Ikkaten ti nuklear a lugar manipud iti lugar ti bagi ti selula tapno magun-od ti cytoplasmic area. Kamaudiananna, ti Analyze Particles plug-in (ImageJ software) ket naus-usar tapno automatiko a mangkuantipikar kadagiti puntos ti cytoplasmic DNA a mangipakpakita ti mtDNA iti ladawan ti threshold, ken dagiti nagun-od a resulta ket na-normalize iti PN a promedio dagiti CTRL a tukak. Dagiti resulta ket naiyebkas a kas ti promedio a bilang dagiti nucleoside iti tunggal selula.
Panag-analisar ti panagiyebkas ti protina. Usaren ti plug-in ti Image Calculator ti ImageJ tapno matingiting ti panagiyebkas ti protina iti PN iti maymaysa a lebel ti selula. Iti ababa, iti maymaysa-a-suson a konfokal a ladawan ti maitunos a kanal, babaen ti ekuasion: senial = min (mtYFP, antibody), ti mitochondrial a rehion a mangipakpakita ti immunoreaktibidad iti maysa a naikeddeng nga antibody idiay Purkina ket nailasin. Kalpasanna ti lugar ti pixel iti nagbanagan a maskara ket nakuantipikar, ken kalpasanna ket na-normalize iti maitunos a threshold a single-stack a ladawan ti mtYFP a kanal tapno makagun-od ti mitochondrial a paset ti naiparang a protina.
Panag-analisar ti densidad ti selula ti Purkinje. Ti Cell Counter plug-in ti ImageJ ket naus-usar a mangtingiting ti densidad ti Purkinje babaen ti panangbingbingay ti bilang dagiti selula ti Purkinje a nabilang babaen ti kaatiddog ​​ti singsing ti cerebellar nga okupado babaen dagiti nabilang a selula.
Panagsagana ken panagkolekta ti sample. Dagiti utek manipud iti kontrol a grupo ken dagiti Mfn2cKO a tukak ket naipatakder iti 2% PFA/2.5% glutaraldehyde iti 0.1 M phosphate buffer (PB), ken kalpasanna dagiti coronal a paset ket naisagana babaen ti panagusar kadagiti ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Kapuskol 50 aginggana ti 60 μm) Kalpasanna naipatakder iti PB buffer iti 1% nga os tetraoxide ken 1.5% potassium ferrocyanide iti temperatura ti kuarto iti 1 nga oras. Dagiti paset ket nabugguan iti mamitlo babaen ti nadistilo a danum, ken kalpasanna namantsaan iti 70% nga ethanol nga addaan iti 1% nga uranyl acetate iti las-ud ti 20 a minuto. Kalpasanna dagiti paset ket na-dehydrate iti nagraduan nga alkohol ken naikabil iti Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, numero ti katalogo 14040) iti nagbaetan dagiti silicon-coated glass slides, ken kamaudiananna iti 60°C Polimerize iti oven iti 48 nga oras. Ti lugar ti cerebellar cortex ket napili ken dagiti 50 nm nga ultrathin a paset ket naputed iti Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ken napili iti 2×1 mm a gambang a slit grid a nakaluban iti pelikula ti polystyrene. Dagiti paset ket namantsaan babaen ti solusion ti 4% uranyl acetate iti H2O iti las-ud ti 10 a minuto, nabugguan babaen ti H2O iti sumagmamano a daras, kalpasanna babaen ti Reynolds lead citrate iti H2O iti las-ud ti 10 a minuto, ken kalpasanna nabugguan babaen ti H2O iti sumagmamano a daras. Naala dagiti mikrograpo babaen ti transmission electron microscope Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) babaen ti panagusar iti TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Alemania).
Para kadagiti utot a naimpektaran iti AAV, ti utek ket naisina ken naiwa iti 1 mm a kapuskol a sagittal section, ken ti cerebellum ket nasukimaten babaen ti panagusar ti fluorescence microscope tapno mailasin ti AAV-infected ring (kayatna a sawen, mCherry expressing). Dagiti laeng eksperimento a ti panagineksion ti AAV ket agresulta iti nangato unay nga episiensiana iti transduksion ti Purkinje a selula a suson (kayatna a sawen ti gangani a sibubukel a suson) iti saan a basbassit ngem dua nga agsasaruno a singsing ti cerebellar ti maus-usar. Ti AAV-transduced loop ket microdissected para iti maysa a rabii kalpasan ti fixation (4% PFA ken 2.5% glutaraldehyde iti 0.1 M cocoate buffer) ken ad-adda pay a naproseso. Para iti EPON embedding, ti naipatakder a tisyu ket nabugguan babaen ti 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), ken naipatakder iti 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) iti 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) 4 nga Oras, kalpasanna bugguan iti 2 nga oras. Uliten iti 3 a daras babaen ti 0.1 M cocamide buffer. Kalpasanna, ti agpangato a serye ti ethanol ket naus-usar a mangipapudot ti tunggal maysa a solusion ti ethanol iti 4°C iti 15 a minuto tapno ma-dehydrate ti tisyu. Ti tisyu ket nayakar iti propylene oxide ken naipatakder iti maysa a rabii iti EPON (Sigma-Aldrich) iti 4°C. Ikabil ti tisyu iti presko nga EPON iti temperatura ti siled iti 2 nga oras, ken kalpasanna ikabil iti 62°C iti 72 nga oras. Usaren ti ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) ken diamond knife (Diatome, Biel, Switzerland) tapno putden ti 70 nm nga ultrathin sections, ken mantsa iti 1.5% uranyl acetate iti 15 a minuto iti 37°C, ken mantsa babaen ti lead citrate solution iti 4 a minuto. Dagiti elektron a mikrograpo ket naala babaen ti panagusar ti JEM-2100 Plus a transmision nga elektron a mikroskopio (JEOL) a naikkan iti Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ken DigitalMicrograph software (Gatan). Para iti panaganalisar, dagiti elektron a mikrograpo ket nagun-od babaen ti 5000× wenno 10,000× a digital zoom.
Morpolohiko a panaganalisar ti mitochondria. Para kadagiti amin nga analisar, dagiti kontur dagiti indibidual a mitochondria ket manual a naibalabala kadagiti digital a ladawan babaen ti panagusar ti ImageJ a software. Naanalisar dagiti nadumaduma a morpolohiko a parametro. Ti densidad ti mitochondria ket naiyebkas a kas ti porsiento a nagun-od babaen ti panangbingbingay ti dagup a mitochondrial a kalawa ti tunggal maysa a selula babaen ti kalawa ti sitoplasma (lugar ti sitoplasma = kalawa ti selula-ti nukleo ti selula) × 100. Ti kinatimbukel ti mitochondria ket nakuenta babaen ti pormula [4π∙(kalawa/perimetro 2)]. Naanalisar ti ista morpolohia ti mitochondria ken nabingbingay iti dua a kategoria (“tubular” ken “blister”) segun kadagiti kangrunaan a sukogda.
Ti numero ti autophagosome/lysosome ken panaganalisar ti densidad. Usaren ti software ti ImageJ tapno manual a mangibalabala kadagiti kontur ti tunggal maysa nga autophagosome/lysosome iti digital a ladawan. Ti kalawa ti autophagosoma/lisosoma ket naiyebkas a kas ti porsiento a nakuenta babaen ti panangbingbingay ti dagup nga autophagosome/lysosome nga estruktura a kalawa ti tunggal maysa a selula babaen ti kalawa ti sitoplasma (lugar ti sitoplasma=lugar ti selula-kalawa ti nukleo)×100. Ti densidad dagiti autophagosoma/lisosoma ket nakuenta babaen ti panangbingbingay ti dagup a bilang babaen ti bilang dagiti estruktura ti autophagosoma/lisosoma iti tunggal maysa a selula (kadagiti termino ti sitoplasmiko a kalawa) (sitoplasmiko a lugar = selula a lugar-nuklear a lugar).
Labeling para iti acute sectioning ken panagsagana iti sample. Para kadagiti eksperimento a kasapulan ti panagmarka ti glukosa, iyalis dagiti natadem a tedted ti utek iti maysa a pre-incubation chamber, nga addaan iti saturated carbon (95% O2 ken 5% CO2), nangato a Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl 2 ken 2.0 mM MgCl 2, a nabaliwan iti pH 7.4 ken 310 aginggana iti 320 mOsm), a ti glukosa ket 13 C 6- Panagsukat ti glukosa (Eurisotop, numero ti katalogo CLM-1396). Para kadagiti eksperimento a kasapulan ti panagmarka ti pyruvate, iyalis dagiti natadem a tedted ti utek iti nangatngato a Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ken Inayon ti 2.0mM MgCl2, i-adjust iti pH 7.4 ken 310 agingga iti 320mOsm), ken inayon ti 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, numero ti katalogo CLM-1082). Ipaburek dagiti paset iti 90 a minuto iti 37°C. Iti ngudo ti eksperimento, dagiti paset ket napardas a nabugguan babaen ti nadalusan a solusion (pH 7.4) a naglaon ti 75 mM ammonium carbonate, ken kalpasanna na-homogenize iti 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: danum. Kalpasan a dagiti paset ket naipatakder iti yelo iti 30 a minuto, dagiti sample ket nasentripugo iti 21,000 g iti 10 a minuto iti 4°C, ken ti nalawag a supernatant ket namaga iti SpeedVac concentrator. Ti nagbanagan a namaga a metabolite pellet ket naidulin iti -80°C aginggana ti panaganalisar.
Ti likido a kromatograpia-mass spectrometry a panaganalisar kadagiti 13 a C-nailatak nga amino asido. Para iti panaganalisar ti likido a kromatograpia-mass spectrometry (LC-MS), ti metabolite pellet ket nasuspenso manen iti 75μl ti LC-MS a grado a danum (Honeywell). Kalpasan ti panagsentripugo iti 21,000 g iti 5 a minuto iti 4°C, ti 20 μl ti nalawlawag a supernatant ket naus-usar para iti panaganalisar ti panagayus ti amino asido, bayat a ti nabati a paset ti naala ket dagus a naus-usar para iti panaganalisar ti anion (kitaen ti baba). Ti panaganalisar ti amino asido ket naaramid babaen ti panagusar ti dati a nailadawan a benzoyl chloride derivatization protocol ( 55 , 56 ). Iti umuna nga addang, 10μl ti 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) ket nainayon iti 20μl ti metabolite extract, ken kalpasanna 10μl ti 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) ket nainayon iti LC grade ACN. Ti sample ket na-vortex iti apagbiit ken kalpasanna nasentripugo iti 21,000 g iti 5 a minuto iti 20°C. Iyalis ti naikkat a supernatant iti 2 ml nga autosampler vial nga addaan iti conical glass insert (200 μl volume). Dagiti sample ket naanalisar babaen ti panagusar ti Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) a naikonektar iti Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) a nangato a resolusion a presision a masa nga espektrometro (Thermo Fisher Scientific). Para iti panaganalisar, 2μl ti derivatized a sample ket nai-inject iti 100×1.0 mm a nangato ti pigsana a silica T3 a kolum (Danum) a naglaon kadagiti 1.8μm a partikulo. Ti panagayus a rate ket 100μl/min, ken ti sistema ti buffer ket buklen ti buffer A (10 mM ammonium formate ken 0.15% formic acid iti danum) ken buffer B (ACN). Ti gradient ket kastoy: 0%B iti 0 a minuto; 0%B. 0 agingga iti 15% B iti 0 agingga iti 0.1 a minuto; 15 agingga iti 17% B iti 0.1 agingga iti 0.5 a minuto; B iti 17 agingga iti 55% iti 0.5 agingga iti 14 a minuto; B iti 55 agingga iti 70% iti 14 agingga iti 14.5 a minuto; iti 14.5 agingga iti 70 agingga iti 100% B iti 18 a minuto; 100% B iti 18 agingga iti 19 a minuto; 100 agingga iti 0% B iti 19 agingga iti 19.1 a minuto; 0% B iti 19.1 agingga iti 28 a minuto (55, 56). Ti QE-HF nga espektrometro ti masa ket agtartaray iti positibo a wagas ti ionisasion nga addaan iti sakop ti masa iti m/z (masa/karga a ratio) iti 50 aginggana iti 750. Ti naipakat a resolusion ket 60,000, ken ti gain control (AGC) a puntiria ti ion a nagun-od ket 3×106, ken ti kangatuan nga oras ti ion ket 100 milisegundos. Ti taudan ti nabara nga electrospray ionization (ESI) ket agtartaray iti boltahe ti panagisprey iti 3.5 kV, ti temperatura ti kapilaria iti 250°C, ti panagayus ti angin ti kalub iti 60 AU (arbitrary units), ken ti katulongan nga ayus ti angin iti 20 AU. 250°C ti kaaduna. Ti S lens ket naikabil iti 60 AU.
Anion a kromatograpia-MS a panaganalisar kadagiti 13C a naimarka nga organiko nga asido. Ti nabati a metabolite precipitate (55μl) ket naanalisado babaen ti panagusar ti sistema ti Dionex ion chromatography (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) a naikonektar iti QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Iti ababa a pannao, 5μl ti metabolite extract ket nai-inject iti Dionex IonPac AS11-HC a kolum a naikkan iti HPLC (2 mm×250 mm, kadakkel ti partikulo 4μm, Thermo Fisher Scientific) iti push-in partial loop mode nga addaan iti filling ratio a 1. ) Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Sientipiko nga). Ti temperatura ti adigi ket mataginayon iti 30°C, ken ti autosampler ket naikabil iti 6°C. Usaren ti potassium hydroxide cartridge a naikkan iti deionized water tapno mangpataud iti potassium hydroxide gradient babaen ti eluent generator. Panagsina dagiti metabolite iti panagayus a rate iti 380μl/min, nga iyaplikar ti sumaganad a gradient: 0 aginggana iti 3 a minuto, 10 mM KOH; 3 agingga iti 12 a minuto, 10 agingga iti 50 mM KOH; 12 agingga iti 19 a minuto, 50 agingga iti 100 mM KOH; 19 agingga iti 21 a minuto , 100 mM KOH; 21 agingga iti 21.5 a minuto, 100 agingga iti 10 mM KOH. Ti kolum ket na-equilibrate manen iti sidong ti 10 mM KOH iti 8.5 a minuto.
Dagiti na-eluted a metabolito ket naitipon iti 150μl/min nga ayus ti suplemento ti isopropanol kalpasan ti adigi ken kalpasanna maiturong iti nangato a resolusion nga espektrometro ti masa nga agtartaray iti negatibo a wagas ti ionisasion. Ti MS ket mangbanbantay ti masa a sakop manipud iti m/z 50 aginggana iti 750 nga addaan iti resolusion a 60,000. Ti AGC ket naikeddeng iti 1×106, ken ti kangatuan nga oras ti ion ket natengngel iti 100 ms. Ti nabara nga ESI source ket na-operate iti spray voltage a 3.5 kV. Dagiti dadduma pay a setting ti taudan ti ion ket kas dagiti sumaganad: temperatura ti kapilaria 275°C; panagayus ti gas ti kalub, 60 AU; katulongan nga ayus ti gas, 20 AU iti 300°C, ken S lens setting iti 60 AU.
Panag-analisar ti datos dagiti 13C a naimarka a metabolite. Usaren ti software ti TraceFinder (bersion 4.2, Thermo Fisher Scientific) para iti panaganalisar ti datos ti isotope ratio. Ti kinasiasino ti tunggal maysa a kompuesto ket naberipika babaen ti mapagtalkan a reperensia a kompuesto ken agwaywayas a naanalisar. Tapno maaramid ti panaganalisar ti panagpabaknang ti isotopo, ti kalawa ti naala nga ion a kromatogram (XIC) ti tunggal maysa nga isotopo ti 13C (Mn) ket naala manipud iti [M + H] +, a ti n ket ti bilang ti karbon ti target a kompuesto, a maus-usar a mang-analisar kadagiti amino asido wenno ti [ MH] + ket naus-usar a mang-analisar kadagiti anion. Ti kinaumiso ti masa ti XIC ket basbassit ngem lima a paset iti tunggal maysa a milion, ken ti kinaumiso ti RT ket 0.05 a minuto. Ti panaganalisar ti panagpabaknang ket maaramid babaen ti panagkarkulo ti ratio ti tunggal maysa a naduktalan nga isotopo iti kaaduan dagiti amin nga isotopo ti maitunos a kompuesto. Dagitoy a ratio ket naited a kas dagiti porsiento a pateg para iti tunggal maysa nga isotopo, ken dagiti resulta ket naiyebkas a kas ti molar a porsiento a panagpabaknang (MPE), a kas nailadawan iti napalabas (42).
Ti nagyelo a neuron pellet ket na-homogenize iti nalamiis a yelo a 80% a metanol (v/v), na-vortex, ken naipatakder iti -20°C iti las-ud ti 30 a minuto. Vortex manen ti sample ken kiwaren iti +4°C iti 30 a minuto. Ti sample ket nasentripugo iti 21,000 g iti 5 a minuto iti 4°C, ken kalpasanna ti nagbanagan a supernatant ket naurnong ken namaga babaen ti panagusar ti SpeedVac concentrator iti 25°C para iti sumaganad a panaganalisar. Kas nailadawan iti ngato, ti LC-MS analysis ket naaramid kadagiti amino acid dagiti naurnos a selula. Babaen ti panagusar ti TraceFinder (bersion 4.2, Thermo Fisher Scientific), ti panaganalisar ti datos ket naaramid babaen ti panagusar ti monoisotopic a masa ti tunggal maysa a kompuesto. Ti kuantil a normalisasion ti datos ti metabolite ket naaramid babaen ti panagusar ti preprocessCore a pakete ti software ( 57 ).
Panagsagana iti slice. Napardas a na-anesthetize ti ipus babaen ti carbon dioxide ken naputolan ti ulo, napardas a naikkat ti utek manipud iti kalasag, ken ti napno iti yelo nga agtayyek a kutsilio (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemania) ket nausar a mangputed iti daytoy iti 300 agingga iti 375 μm a sagittal sections Cold carbon gasification (95% O2 ken 5% CO2) Nababa Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 ken 6.0 mM MgCl2 Ibagay iti pH 7.4 ken 310 agingga iti 330 mOsm). Iyalis dagiti nagun-od a tedted ti utek iti kamara nga addaan iti nangatngato a Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 ken mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ken 310 agingga iti 320 mOsm). Idulin dagiti ngilaw iti 20 agingga iti 30 a minuto tapno maisubli sakbay a mairekord.
panagrekord. Maysa nga entablado ti mikroskopio a naikkan iti naipasdek a siled ti panagrekord ken 20x water immersion objective lens (Scientifica) ti nausar para iti amin a panagrekord. Dagiti maipagarup a selula ti Purkinje ket nailasin babaen ti (i) kadakkel ti bagi, (ii) anatomiko a lokasion ti cerebellum, ken (iii) panagiyebkas ti fluorescent mtYFP reporter gene. Ti patch pipette nga addaan iti resistensia ti murdong iti 5 agingga iti 11 megohms ket maguyod babaen ti borosilicate glass capillary (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemania) ken ti horizontal a pipette Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Amin a panagrekord ket inaramid babaen ti ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Alemania), a kontrolado babaen ti software a Signal (bersion 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Ti eksperimento ket nairekord iti sampling rate a 12.5 kHz. Ti signal ket nasala babaen ti dua nga short-pass a Bessel filter nga addaan kadagiti cutoff frequency iti 1.3 ken 10 kHz a nagsasaruno. Ti kapasidad ti membrane ken ti pipeta ket mabayadan babaen ti compensation circuit babaen ti panagusar ti amplifier. Amin nga eksperimento ket naaramid babaen ti panangtengngel ti Orca-Flash 4.0 a kamera (Hamamatsu, Gerden, Alemania), a kontrolado babaen ti software ti Hokawo (bersion 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemania).
Rutina a sibubukel-selula a konfigurasion ken panaganalisar. Sakbay a dagus ti panagrekord, punnuen ti pipeta iti makin-uneg a solusion nga addaan kadagiti sumaganad a substansia: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) ken Ti 10.0 mM a creatinine phosphate ket nabaliwan iti pH 7.25, ken ti osmotiko a presion ket 290 mOsm (sukrosa). Dagus kalpasan ti panangipakat iti puersa a 0 pA tapno maburak ti membrane, narukod ti potensial ti aginana a membrane. Ti resistensia ti input ket marukod babaen ti panangipakat kadagiti hyperpolarized currents ti -40, -30, -20, ken -10 pA. Rukoden ti kadakkel ti sungbat ti boltahe ken usaren ti linteg ni Ohm tapno makalkula ti input resistance. Ti spontaneous activity ket nairekord iti voltage clamp iti 5 a minuto, ken ti sPSC ket nailasin ken narukod iti Igor Pro (bersion 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) babaen ti panagusar ti semi-automatic recognition script. Ti kurba ti IV ken ti steady-state current ket marukod babaen ti panangi-clamp ti bateria kadagiti nadumaduma a potensial (mangrugi manipud iti -110 mV) ken panangpaadu ti boltahe kadagiti 5 mV nga addang. Nasubok ti pannakapataud ti AP babaen ti panangipakat iti depolarizing current. I-clamp ti selula iti -70 mV bayat ti panangipakat iti depolarizing current pulse. Baliwan ti kadakkel ti addang ti tunggal recording unit a naisina (10 agingga iti 60 pA). Karkuloen ti kangatuan a frekuensia ti AP babaen ti manual a panagbilang kadagiti pulse spike a pakaigapuan ti kangatuan a frekuensia ti AP. Ti AP a pagrukodan ket naanalisar babaen ti panagusar ti maikadua a nagtaud ti pulso ti depolarisasion nga umuna a mangtignay ti maysa wenno ad-adu pay nga AP.
Nabuong a patch a konfigurasion ken panaganalisar. Mangaramid ti perforated patch recording babaen ti panagusar kadagiti gagangay a protocol. Usaren ti ATP- ken GTP-free a pipette nga awan ti linaonna kadagiti sumaganad a ramen: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ken 2 mM MgCl2, ken ag-adjust iti pH 7.2 (nga agusar iti KOH). Ti ATP ken GTP ket naikkat manipud iti intraselullar a solusion tapno malapdan ti di makontrol a panaglaok ti membrane ti selula. Ti patch pipette ket napno iti amphotericin-a naglaon iti akin-uneg a solusion (agarup a 200 aginggana iti 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) tapno makagun-od iti nasuntok a rekord ti patch. Ti amphotericin ket narunaw iti dimethyl sulfoxide (maudi a konsentrasion: 0.1 aginggana iti 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ti konsentrasion ti DMSO a nausar ket awan ti dakkel nga epektona kadagiti neuron a naadal. Bayat ti proseso ti panagsuntok, ti ​​resistensia ti kanal (Ra) ket agtultuloy a namonitor, ken ti eksperimento ket nairugi kalpasan a ti amplitudo ti Ra ken AP ket natalged (20-40 a minuto). Marukod ti espontaneo nga aktibidad iti boltahe ken/wenno current clamp iti 2 agingga iti 5 a minuto. Ti panaganalisar ti datos ket naaramid babaen ti panagusar ti Igor Pro (bersion 7.05.2, WaveMetrics, E.U.A.), Excel (bersion 2010, Microsoft Corporation, Redmond, E.U.A.) ken GraphPad Prism (bersion 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Estados Unidos). Tapno mailasin dagiti espontaneo nga AP, maus-usar ti NeuroMatic v3.0c plug-in ti IgorPro. Automatiko a mailasin dagiti AP babaen ti panagusar ti naited a pagrukodan, a nabaliwan a saggaysa para iti tunggal maysa a rekord. Babaen ti panagusar ti spike interval, ikeddeng ti spike frequency nga addaan iti maximum instantaneous spike frequency ken ti promedio a spike frequency.
PN nga panagbukod. Babaen ti panagadaptasion iti dati a naipablaak a protocol, dagiti PN ket nadalus manipud iti cerebellum ti ipus iti naikeddeng a tukad ( 58 ). Iti ababa a pannao, ti cerebellum ket naikkat ken napaglalaok iti yelo a nalamiis a dissociation medium [nga awan ti HBSS Ca2+ ken Mg2+, nainayon iti 20 mM a glucose, penicillin (50 U/ml) ken streptomycin (0.05 mg/ ml)], ken kalpasanna narunaw ti medium iti papain [HBSS, nainayon iti 1-cysteine·HCl (1 mg / ml), papain (16 U / ml) ken deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Agasan iti 30 a minuto iti 30°C. Umuna a bugguan dagiti tisyu iti HBSS medium nga addaan iti egg mucus (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ken DNase (0.1 mg/ml) iti temperatura ti kuarto tapno malapdan ti enzymatic digestion, ken kalpasanna iti HBSS medium nga addaan iti 20 mM glucose Siaannad a gilingen iti HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) ken Ti DNase (0.1 mg/ml) ket mangiruar kadagiti agmaymaysa a selula. Ti nagbanagan a suspension ti selula ket nasala babaen ti 70μm a pagsala ti selula, kalpasanna dagiti selula ket na-pellet babaen ti sentripugo (1110 rpm, 5 a minuto, 4°C) ken nasuspenso manen iti medium ti panagurnos [HBSS, nainayon iti 20 mM a glukosa, 20% a fetal bovine ) Serum, penicillin (50 U/ml) ken streptomycin (0.05 mg/ml)]; sukimaten ti panagbiag ti selula babaen ti propidium iodide ken baliwan ti densidad ti selula iti 1×106 agingga iti 2×106 a selula/ml. Sakbay ti flow cytometry, ti suspension ket nasala babaen ti 50 μm cell strainer.
Flow cytometer ti panagayus. Ti panagurnos ti selula ket naaramid iti 4°C babaen ti panagusar ti makina ti FACSAria III (BD Biosciences) ken software ti FACSDiva (BD Biosciences, bersion 8.0.1). Ti suspension ti selula ket naurnos babaen ti panagusar ti 100 μm a nozzle iti sidong ti presion ti 20 psi iti rate ti ~2800 a pasamak/sek. Gapu ta dagiti tradisional a pagalagadan ti panagserrek (kadakkel ti selula, bimodal a diskriminasion, ken dagiti pakabigbigan ti panagiwarwaras) ket saan a makasigurado ti umno a pannakaisina ti PN manipud kadagiti sabali a kita ti selula, ti estratehia ti gating ket naikeddeng a naibatay iti direkta a panagidilig ti kapigsa ti YFP ken autofluorescence iti mitoYFP+ ​​ken ti kontrol a mitoYFP − Mice. Ti YFP ket magagaran babaen ti panangi-iradiate ti sample babaen ti 488 nm a linia ti laser, ken ti signal ket naduktalan babaen ti panagusar ti 530/30 nm a banda a panaglabas a pagsala. Kadagiti mitoYFP+ ​​a tukak, ti ​​relatibo a pigsa ti Rosa26-mitoYFP reporter gene ket maus-usar pay a mangilasin kadagiti neuronal a bagi ken dagiti pirgis ti axon. Ti 7-AAD ket magagaran babaen ti 561 nm a duyaw a laser ken naduktalan babaen ti 675/20 nm a bandpass filter tapno mailaksid dagiti natay a selula. Tapno maisina dagiti astrocyte iti aggigiddan, ti suspension ti selula ket namantsaan babaen ti ACSA-2-APC, kalpasanna ti sample ket nairradia babaen ti 640 nm a linia ti laser, ken ti 660/20 nm a bandpass filter ket naus-usar a mangduktal ti signal.
Dagiti naurnong a selula ket na-pellet babaen ti centrifugation (1110 rpm, 5 a minuto, 4°C) ken naidulin iti -80°C aginggana ti pannakausar. Dagiti Mfn2cKO mice ken dagiti litter pups-da ket naklasipika iti isu met laeng nga aldaw tapno mapabassit ti procedural variability. Ti presentasion ken panaganalisar ti datos ti FACS ket naaramid babaen ti panagusar ti FlowJo software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Kas nadakamat iti ngato (59), ti aktual nga oras a PCR ket maus-usar a mangisina ti DNA manipud kadagiti naurnos a neuron para iti sumaganad a panagkuantipika ti mtDNA. Ti linearity ken threshold sensitivity ket immuna a nasubok babaen ti panagtaray ti qPCR kadagiti nadumaduma a bilang dagiti selula. Iti ababa a pannao, urnongen ti 300 PN iti lysis buffer a buklen ti 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ken proteinase K (200 ng/ml) ken ipaburek iti 55°C iti 120 a minuto. Dagiti selula ket ad-adda pay a naipatakder iti 95°C iti las-ud ti 10 a minuto tapno masigurado ti naan-anay nga inactivation ti proteinase K. Babaen ti panagusar ti TaqMan probe (Thermo Fisher) nga espesipiko iti mt-Nd1, ti mtDNA ket narukod babaen ti semi-quantitative PCR iti 7900HT Real-Time PCR system (Thermo Fisher Scientific). Siensia, numero ti katalogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numero ti katalogo AIVI3E8) ken 18S (Thermo Fisher Scientific, numero ti katalogo Hs99999901_s1) a gene.
Panagisagana ti sample ti proteoma. Babaen ti panangpapudot ti solusion iti 95°C iti 10 a minuto ken panagsonika, iti lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide ken 100 mM tris- Lyse frozen neuron pellets iti HCl]. Iti Bioruptor (Diagenode) iti 10 a minuto (30 a segundo a pulso / 30 a segundo a panawen ti panagsardeng). Ti sample ket nabartek iti 1:10 iti 20 mM tris-HCl (pH 8.0), nalaokan iti 300 ng trypsin gold (Promega), ken naipatakder iti maysa a rabii iti 37°C tapno magun-od ti naan-anay a panagrunaw. Iti maikadua nga aldaw, ti sample ket nasentripugo iti 20,000 g iti 20 a minuto. Ti supernatant ket nabartek babaen ti 0.1% a pormiko nga asido, ken ti solusion ket naikkat ti asin babaen dagiti bukod nga inaramid a StageTips. Ti sample ket namaga iti instrumento ti SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) iti 45°C, ken kalpasanna ti peptido ket naibitin iti 0.1% a pormiko nga asido. Amin a sample ket naggigiddan nga insagana ti isu met laeng a tao. Tapno mausig dagiti sample ti astrocyte, dagiti 4 μg a naikkat ti asin a peptido ket naimarka babaen ti tandem mass tag (TMT10plex, numero ti katalogo 90110, Thermo Fisher Scientific) nga addaan iti peptide iti TMT reagent ratio iti 1:20. Para iti panagmarka ti TMT, ti 0.8 mg ti TMT a reahensia ket nasuspende manen iti 70 μl ti awan danum nga ACN, ken ti namaga a peptido ket nabukel manen iti 9 μl ti 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), a daytoy ket nainayon ti 7 μl ti TMT a reahensia iti ACN. Ti konsentrasion ket 43.75%. Kalpasan ti 60 a minuto a panaginkubasion, ti reaksion ket naiddep babaen ti 2 μl ti 5% a hydroxylamine. Dagiti naimarka a peptido ket naurnong, namaga, nasuspenso manen iti 200μl ti 0.1% a pormiko nga asido (FA), nabingbingay iti dua, ken kalpasanna naikkat ti asin babaen ti panagusar kadagiti bukod a naaramid a StageTips. Babaen ti panagusar ti UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), maysa kadagiti dua a kagudua ket nabingbingay iti 1mm x 150mm Acquity chromatographic a kolum a napno kadagiti 130Å1.7μm C18 a partikulo (Waters, katalogo No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Sientipiko nga). Pagsisinaen dagiti peptido iti panagayus a rate a 30μl/min, isina manipud iti 1% agingga iti 50% a buffer B iti 85 a minuto nga addaan iti stepwise gradient iti 96 a minuto, manipud 50% agingga iti 95% a buffer B iti 3 a minuto, kalpasanna 8 a minuto para iti 95 % Buffer B; Ti buffer A ket 5% ACN ken 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), ken ti buffer B ket 80% ACN ken 10 mM ABC. Mangurnong kadagiti fractions iti tunggal 3 a minuto ken pagtitiponen dagitoy iti dua a grupo (1 + 17, 2 + 18, kdpy.) ken pagpamagaen dagitoy iti vacuum centrifuge.
Panag-analisar ti LC-MS/MS. Para iti espektrometria ti masa, dagiti peptido (numero r119.aq) ket naisina iti 25 cm, 75 μm nga akin-uneg a diametro a PicoFrit analitikal nga adigi (baro a panggep a lente, numero ti paset PF7508250) a naikkan iti 1.9 μm a ReproSil-Pur 120 C18-AQ a medium (Dr. Maisch, mat), agusar iti EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher a Sientipiko, Alemania). Nataginayon ti adigi iti 50°C. Dagiti buffer A ken B ket 0.1% a pormiko nga asido iti danum ken 0.1% a pormiko nga asido iti 80% nga ACN, agpada. Dagiti peptido ket naisina manipud iti 6% aginggana iti 31% a buffer B iti las-ud ti 65 a minuto ken manipud iti 31% aginggana iti 50% a buffer B iti las-ud ti 5 a minuto nga addaan iti gradient a 200 nl/min. Dagiti na-eluted a peptido ket naanalisar iti Orbitrap Fusion mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Ti panagrukod ti peptido a prekursor m/z ket maaramid nga addaan iti resolusion iti 120,000 iti sakop ti 350 aginggana ti 1500 m/z. Babaen ti panagusar ti 27% a normalisado nga enerhia ti panagdinnungpar, ti kapigsaan a prekursor nga addaan iti kasasaad ti karga iti 2 aginggana iti 6 ket napili para iti nangato nga enerhia a C trap dissociation (HCD) a panagpisi. Ti oras ti siklo ket naikeddeng iti 1 s. Ti pateg ti m/z ti pirgis ti peptido ket narukod iti silo ti ion babaen ti panagusar ti kabassitan nga AGC a puntiria iti 5×104 ken ti kangatuan nga oras ti panagineksion iti 86 ms. Kalpasan ti pannakabingbingay, ti prekursor ket naikabil iti dinamiko a listaan ​​ti pannakailaksid iti las-ud ti 45 s. Dagiti peptido a naimarka iti TMT ket naisina iti 50 cm, 75 μm nga Acclaim PepMap a kolum (Thermo Fisher Scientific, numero ti katalogo 164942), ken dagiti espektro ti panagakar ket naanalisado iti Orbitrap Lumos Tribrid mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) a naikkan kadagiti nangato a tay-ak nga asimetriko a waveform ions (FAIMS) nga alikamen (Thermo Fisher Scientific) ket agtartaray kadagiti dua a boltahe ti kompensasion iti −50 ken −70 V. Ti MS3 a napili a naibatay iti prekursor ti panagsinkronisar ket maus-usar para iti panagrukod ti senial ti ion ti reporta ti TMT. Ti panagsisina ti peptido ket naaramid iti EASY-nLC 1200, babaen ti panagusar ti 90% a linear a gradient elution, nga addaan iti konsentrasion ti buffer iti 6% aginggana iti 31%; ti buffer A ket 0.1% FA, ken ti buffer B ket 0.1% FA ken 80% ACN. Ti analitikal a kolum ket mapaandar iti 50°C. Usaren ti FreeStyle (bersion 1.6, Thermo Fisher Scientific) tapno mabingay ti orihinal a file segun iti boltahe ti kompensasion ti FAIMS.
Panangilasin ken panangkuantipika iti protina. Babaen ti panagusar ti naikaykaysa a makina ti panagbiruk ti Andromeda, ti orihinal a datos ket naanalisado babaen ti panagusar ti MaxQuant bersion 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Iti pay maipatinayon kadagiti panagsasaruno ti Cre rekombinase ken YFP a naala manipud iti Aequorea victoria, dagiti espektro ti pirgis ti peptido ket nabirokan para iti kanonikal a panagsasaruno ken panagsasaruno ti isoporma ti reperensia a proteoma ti ipus (Proteome ID UP000000589, nai-download manipud iti UniProt idi Mayo 2017) . Ti oksidasion ti metionina ken ti protina nga N-terminal nga asetilasion ket naikeddeng a kas dagiti nadumaduma a panagbalbaliw; ti cysteine ​​carbamoyl methylation ket naikeddeng a kas dagiti naikeddeng a panagbalbaliw. Dagiti parametro ti panagrunaw ket naikeddeng iti “specificity” ken “trypsin/P”. Ti kabassitan a bilang dagiti peptido ken labaha a peptido a maus-usar para iti pannakailasin ti protina ket 1; ti kabassitan a bilang dagiti naisangayan a peptido ket 0. Iti sidong dagiti kasasaad ti panagtunos ti mapa ti peptido, ti rate ti pannakailasin ti protina ket 0.01. Na-enable ti pagpilian a “Second Peptide.” Usaren ti pagpilian a “match between runs” tapno mayakar dagiti naballigi a pannakailasin iti nagbaetan dagiti nadumaduma nga orihinal a file. Usaren ti LFQ minimum ratio count 1 para iti label-free quantification (LFQ) (60). Ti kapigsa ti LFQ ket nasala para iti saan a basbassit ngem dua a balido a pateg iti saan a basbassit ngem maysa a grupo ti genotipo iti tunggal maysa a puntos ti panawen, ken na-ekstrapola manipud iti gagangay a pannakaiwaras nga addaan iti kalawa ti. 0.3 ken agpababa iti 1.8. Usaren ti plataporma ti panagkomputar ti Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ken R (https://r-project.org/) tapno analisaen dagiti resulta ti LFQ. Ti dua-a-dalan a kalalainganna a t a panagsubok manipud iti pakete ti software ti limma ket naus-usar para iti panaganalisar ti diferensial nga ebkas ( 61 ). Ti eksploratibo a panaganalisar ti datos ket naaramid babaen ti panagusar ti ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ken pheatmap. Ti datos ti proteomics a naibatay iti TMT ket naanalisar babaen ti panagusar ti MaxQuant bersion 1.6.10.43. Agbirok ti raw proteomics data manipud iti human proteomics database ti UniProt, a nai-download idi Septiembre 2018. Ti panaganalisar ket mairaman ti isotope purity correction factor nga inted babaen ti agpatpataud. Usaren ti limma iti R para iti panaganalisar ti diferensial nga ebkas. Ti orihinal a datos, dagiti resulta ti panagbiruk ti database, ken ti panagayus ti trabaho ti panaganalisar ti datos ken dagiti resulta ket naidulin amin iti aliansa ti ProteomeXchange babaen ti pagidulinan ti kasosio ti PRIDE nga addaan iti pakabigbigan ti data set a PXD019690.
Dagiti panagandar nga anotasion ket mangpabaknang ti panaganalisar. Ti ramit ti Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ket naus-usar tapno maikeddeng ti kinabaknang dagiti termino ti panagandar nga anotasion ti datos a naikeddeng iti 8 a lawas (Pigura 1). Iti ababa a pannao, ti kantitatibo a listaan ​​ti protina a naala manipud iti LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) a panaganalisar ti datos ket naus-usar kadagiti sumaganad a pagalagadan ti pagsala: Ti Mus musculus ket napili a kas ti sebbangan ken likudan, ken ti kategoria ket mangipakita ti pateg ti P a nabaliwan babaen ni Benjamini para iti panagpabaknang iti 0.05 wenno nababbaba ket naibilang a naipangpangruna. Para iti daytoy a grapo, dagiti kangatuan a lima a sobra a kategoria iti tunggal maysa a gunglo a naibatay iti nabaliwan a pateg ti P ket naipakita. Babaen ti panagusar ti adu a t-panangsubok, babaen ti panagusar ti dua-a-tukad a linear a programa ti panagparang-ay da Benjamini, Krieger, ken Yekutieli (Q = 5%), ti panaganalisar ti panagiyebkas ti protina ti kurso ti oras ket maaramid kadagiti napateg a kandidato a nailasin iti tunggal maysa a kategoria, ken tunggal maysa a linia ket naanalisar a naisina. Saan a kasapulan nga anamongan ti agtultuloy nga SD.
Tapno maipada dagiti resulta daytoy a panagadal kadagiti naipablaak a database ken mangpataud ti Venn a diagrama iti Figura 1, pinagtiponmi ti kantitatibo a listaan ​​ti protina kadagiti MitoCarta 2.0 nga anotasion ( 24 ). Usaren ti online nga alikamen ti Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) tapno mangpataud ti diagrama.
Para iti detalyado nga impormasion kadagiti estadistikal a pamay-an a maus-usar para iti panaganalisar ti proteomics, pangngaasi a kitaen ti maitunos a benneg dagiti Materiales ken Pamay-an. Para iti amin a dadduma pay nga eksperimento, ti detalyado nga impormasion ket mabalin a masarakan iti katupag a sarsarita. Malaksid no naikeddeng ti sabali, amin a datos ket naiyebkas a kas ti kaatiddogan ± SEM, ken amin nga estadistikal a panaganalisar ket naaramid babaen ti panagusar ti GraphPad Prism 8.1.2 a software.
Para kadagiti suplementario a materiales para iti daytoy nga artikulo, pangngaasi a kitaen ti http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Daytoy ket maysa nga artikulo ti silulukat a panagserrek a naiwarwaras babaen dagiti kondision ti Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, a mangipalubos ti panagusar, panagiwaras ken panagpaadu iti ania man a medium, no la ketdi ti maudi a panagusar ket saan a para iti komersial a gunggona ken ti premisa ket ti orihinal nga obra ket umiso. Reperensia.
Pakaammo: Kiddawenmi laeng nga itedmo ti email address-mo tapno ammo ti tao nga irekomendarmo iti panid a kayatmo a makitada ti email ken saan nga spam dayta. Saanmi a matiliw ti aniaman nga email address.
Daytoy a saludsod ket mausar a mangsubok no maysaka a bisita ken manglapped iti automatiko a panagipatulod ti spam.
Ni E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson, ni Larson
Impalgak ti proteomics analysis kadagiti dysfunctional neuron a dagiti metaboliko a programa ket mapaaktibo tapno makontra ti neurodegeneration.
Ni E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson, ni Larson
Impalgak ti proteomics analysis kadagiti dysfunctional neuron a dagiti metaboliko a programa ket mapaaktibo tapno makontra ti neurodegeneration.
©2020 Kappon ti Amerikano para iti Panagrang-ay ti Siensia. amin a karbengan ket naisagana. Ti AAAS ket kasosio ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ken COUNTER. Dagiti Panagrang-ay ti Siensia ISSN 2375-2548.