Agdama†Agdama nga adres: OX11 0DE, UK, Pasdek ti Diamante, Parke ti Siensia ken Panagbalbaliw ti Harwell, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektronika a Biolohiko a Sentro ti Panag-imahe.
Ti sentro ti reaksion a light-harvesting complex 1 (RC-LH1) ket isu ti kangrunaan a potosintetiko a paset dagiti lila a pototropiko a bakteria. Inyam-ammomi ti dua nga estruktura ti cryo-electron microscopy ti RC-LH1 a komplikado manipud iti Rhodopseudomonas palustris. Ti 2.65-Å a resolusion nga estruktura ti RC-LH114-W a komplikado ket buklen dagiti 14 a subunit LH1 a lubong a manglikmut iti RC, a nasinga babaen ti protina W, bayat a ti komplikado nga awanan iti protina-W ket naan-anay nga RC a komposision a napalikmutan babaen ti RC. Naserraan ti 16 a subunit LH1 a lubong. Ti panagidilig kadagitoy nga estruktura ket mangipaay kadagiti pannakaammo iti dinamika ti quinone iti RC-LH1 a komplikado, a mairaman dagiti dati a saan a naikeddeng a panagbalbaliw ti konpormasion no agsilpo ti kinone iti lugar ti RC QB, ken kasta met ti lokasion dagiti katulongan a lugar ti panagsilpo ti quinone, a makatulong a Mangpasa kadagitoy iti RC. Ti naisangayan nga estruktura ti protina ti W ket manglapped ti panagserra ti LH1 a lubong, iti kasta ket mangpataud ti kanal para iti panangpapartak ti panagsinnukat ti quinone/quinolone.
Ti enerhia nga ipaay ti photosynthesis ket makasustiner iti dandani amin a biag ditoy daga, ken dakkel ti potensialna para iti solar biotechnology. Bayat a mangitantandudo ti sangalubongan a potosintesis, dagiti lila a pototropiko a bakteria ket mangipakpakitada pay kadagiti nadumaduma a wagas ti enerhia ken dagiti metaboliko a kabaelan. Mabalinda a liklikan ti photosynthesis ken dumakkel kas heterotrophic bacteria iti nasipnget, mabalinda nga ilinteg ti nitroheno ken carbon dioxide, mangpataud iti hidrohena, ken mangdadael kadagiti nabanglo a kompuesto (1-3). Tapno maipaay ti enerhia kadagitoy a proseso, masapul a napartak ken episiente a mabaliwan ti lawag iti kemikal nga enerhia. Daytoy a proseso ket mangrugi no ti light-trapping antenna complex ket agsepen ti lawag ken iyakarna ti naibalud nga enerhia iti sentro ti reaksion (RC), iti kasta mangrugi ti panagsina ti karga (4 – 7). Ti batayan a yunit ti potosintesis kadagiti lila a pototropiko a bakteria ket buklen ti tipo 2 nga RC, a napalikmutan babaen ti light-harvesting complex 1 (LH1), a mangporma ti RC-LH1 a kangrunaan a komplikado. Ti LH1 ket naporma babaen ti maysa a panagurnos dagiti kurbado nga αβ a heterodimero, a tunggal maysa kadagitoy ket mangisilpo ti dua a bakteria a kloropila (BChl) a molekula ken maysa wenno dua a karotenoid (8-12). Ti kasimplean nga antena ti LH1 ket buklen dagiti 16 wenno 17 nga αβ heterodimero a manglikmut iti RC (9-13) iti naserraan a lubong, ngem kadagiti sabali a kangrunaan a komplikado, dagiti transmembrane a peptido ket mangsinga ti panagtultuloy ti aglawlaw ti LH1 , Iti kasta ket mangitandudo ti panagsaknap ti quinol/quinone iti nagbaetan ti RC ken ti sitokromo bc1 a komplikado (11, 13-15). Ti lila a pototropiko a mula a Rhodopseudomonas (Rps.) ket maysa a modelo nga organismo a makaawat ti enerhia ken panagiyakar ti elektron a mangsuporta ti potosintesis. Ti umuna nga estruktura ti kristal ti Rps. Ti modelo ti palustris RC-LH1 complex ket ti RC, a napalikmutan iti 15 a heterodimeric LH1 loop, a nasinga babaen ti di ammo a protina a maawagan iti “Protina W” (14). Ti protina-W ket kalpasanna ket nailasin a kas ti RPA4402, nga isu daytoy ket maysa a saan a nailasin a 10.5kDa a protina nga addaan iti tallo a naipadto a transmembrane helices (TMH) ( 16 ). Isingasingmi a baliwan ti nagan ti rpa4402 a gene a mangikodigo ti protina W iti pufW tapno maitunos iti nomenklatura a naus-usar para kadagiti gene a mangikodigo kadagiti subunit ti RC-L, M (pufL, pufM) ken LH1α, β (pufA, pufB). Makapainteres, ti protina-W ket adda laeng iti agarup a 10% ti RC-LH1, a mangipalgak ti Rps. ti palustris ket mangpataud ti dua a nagduduma nga RC-LH1 a komplikado. Ditoy, ireportmi dagiti nangato a resolusion a cryo-EM (cryo-EM) nga estruktura ti dua a kangrunaan a komplikado, ti maysa ket addaan iti protina W ken 14 nga αβ a heterodimero, ti sabali ket awanan iti protina W ken ti naserraan a 16 Heterodimer LH1 a lubong. Ti estrukturami ket mangibagi ti maysa nga addang a panagbalbaliw iti pannakaawat ti RC-LH1 a komplikado ti Rps. palustris, gapu ta inanalisarmi ti homoheno a populasion ti tunggal maysa a variant ken addaankami iti umdas a resolusion tapno nalawag a mangituding iti tunggal maysa a peptido ken dagiti naisinggalut a pigmento ken dagiti mainaig a lipido ken quinones. Ti panagidilig kadagitoy nga estruktura ket mangipakita a dagiti tallo a protina ti TMH-W a saan pay a nasarakan iti ania man a sabali nga RC-LH1 a komplikado aginggana ita ket mangpataud ti maysa a kanal ti kinone tapno mapapartak ti panagsinnukat ti quinone/quinolone. Sumagmamano a napreserba a lipido ken quinone a pagsilpoan a lugar ket nailasin, ken impalgakmi ti baro a panagbalbaliw ti konpormasion kalpasan ti kombinasion ti quinone ken RC, a mabalin a maibagay para iti potosistema II (PSII) RC dagiti oksihena a pototropiko nga organismo. Dagiti natakuatanmi ket mangipaay kadagiti baro a pannakaammo iti kinetika ti panagsilpo ken panagsinnukat ti quinone/quinolone iti RC-LH1 a kangrunaan a komplikado dagiti lila a pototropiko a bakteria.
Tapno mapasayaat ti detalyado a panagadal kadagiti dua a komplikado a masarakan iti Rps. palustris, isinatayo ti tunggal RC-LH1 babaen kadagiti biokemikal a pamay-an. Ti protina W-a-kurang a komplikado (manipud ditoy ket makunkuna a kas ti ΔpufW) ket nadalus manipud iti kita nga awanan iti pufW a gene ( 16 ), ken maysa laeng nga RC-LH1 a komplikado ti mabalin a mapataud. Ti protina W-containing complex ket patauden ti maysa a kita. Ti protina W daytoy a kita ket nabaliwan babaen ti 10x His tag iti C-terminusna, tapno ti protina W-a naglaon a komplikado ket mabalin nga epektibo a maitipon iti kaaduan nga awanan a protina W babaen ti panangipatakder ti metal. Ti komplikado ket epektibo a naisina (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Kas naipakita iti Figura 1, agpada a dagiti komplikado ket aglaon ti tallo a sub-unit nga RC (RC-L, RC-M ken RC-H) a napalikmutan babaen ti LH1 nga antena. Ti 2.80-A nga estruktura ti komplikado nga awanan iti protina-W ket mangipakita kadagiti 16 nga αβ a heterodimero, a mangporma ti naserraan nga LH1 a lubong a naan-anay a manglikmut iti RC, manipud ditoy ket naibagbaga a kas ti RC-LH116 a komplikado. Ti 2.65Å nga estruktura ti protina-W-a naglaon a komplikado ket addaan iti 14-heterodimer LH1 a nasinga babaen ti protina-W, manipud ditoy ket naibagbaga a kas ti RC-LH114-W.
(A ken B) Pannakabagi ti rabaw ti kompuesto. (C ken D) Dagiti naisinggalut a pigmento a nayebkas kadagiti barayuboy. (E ken F) Dagiti komplikado a napaliiw manipud iti rabaw ti sitoplasmiko ket addaan kadagiti peptido ken dagiti subunit ti LH1 a naibagbaga kadagiti cartoon, ken nanumeroan iti agpakannawan manipud iti protina-W a giwang [a maitunos iti panagnumero ti Rba. dagiti komplikado nga sphaeroides (13)]. Para iti LH1-α, ti kolor ti subunit ti protina ket duyaw; para iti LH1-β, ti kolor ti subunit ti protina ket asul; para iti protina-W, nalabaga ti protina; para iti RC-H, cyan dayta; para iti RC-L, Kahel dayta; para iti RC-M, magenta. Dagiti cofactor ket naibagbaga babaen dagiti baras, ti berde ket mangibagi kadagiti molekula ti BChl ken BPh a, ti lila ket mangibagi kadagiti carotenoid, ken ti duyaw ket mangibagi kadagiti molekula ti UQ10. (G ken H) Napadakkel a panagkita ti protina-W a giwang iti katupag a rehion ti RC-LH114-W a komplikado (G) ken RC-LH116 a komplikado (H). Dagiti cofactor ket maiparang iti porma ti panagpunno ti espasio, ti chelated quinone ket maiparang iti asul. Ti giwang ti protina-W ket naitampok babaen ti asul a nagtimbukel a linia iti (G), ken dagiti babassit nga abut a sadiay ket agsaknap ti quinone/quinolol iti singsing ti LH116 ket naitampok babaen ti nangisit a nagtimbukel a linia iti (H).
Ti Figura 1 (A ken B) ket mangipakita ti RC a napalikmutan babaen dagiti silulukat wenno naserraan nga urnos dagiti LH1αβ a heterodimero, a tunggal maysa kadagitoy ket mangisilpo ti dua a BChl ken maysa a carotenoid (Pigura 1, C ken D). Impakita dagiti napalabas a panagadal a ti Rps ti LH1 complex. Iti biosintetiko a dalan ti spirulina xanthin, dagitoy a sebbangan ket aglaon kadagiti naglaok a populasion dagiti carotenoid ( 17 ). Nupay kasta, ti spiropyrroxanthin ti dominante a carotenoid ken makapnek ti densidadna. Gapuna, pinilimi a modeloen ti spiroxanthin kadagiti amin a lugar ti panagsilpo ti LH1. Dagiti alpha ken beta a polipeptido ket dagiti agmaymaysa a TMH nga addaan kadagiti ababa a membrane nga akinruar a rehion (Pigura 1, A, B, E, ken F). Urayno ti densidad ti 17 a nabati iti C-terminus ket saan a napaliiw, ti alpha a polipeptido ket nabingbingay manipud iti Met1 aginggana iti Ala46 kadagiti agpada a komplikado. Ti β a polipeptido ket naikkat manipud iti Gly4 aginggana iti Tyr52 iti RC-LH116, ken manipud iti Ser5 aginggana iti Tyr52 iti RC-LH114-W. Awan ti napaliiw a densidad ti 3 wenno 4 nga N-terminal wenno 13 a C-terminal a residue (Pigura S1). Ti panaganalisar ti espektrometria ti masa ti naglaok nga RC-LH1 a komplikado a naisagana manipud iti atap a kita ti kita ket nangipakita a ti awan a rehion ket resulta ti heterologo a panagpisi kadagitoy a peptido (Pigura S1 ken S2). Ti N-terminal a pormulasion ti α-Met1 ket napaliiw pay (f). Impakita ti panaganalisar a ti α-peptido ket buklen dagiti nabati a fMet1 aginggana iti Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, ken ti β-peptido ket buklen dagiti nabati a Ser2 aginggana iti Ala53, a daytoy ket nasayaat a maitunos iti nababa a temperatura a mapa ti densidad ti EM.
Ti koordinasion ti α-His29 ken β-His36 ket mangaramid kadagiti BChls a rupanrupa; tunggal maysa nga αβ heterodimer ket agtitipon kadagiti kaarrubana tapno mangporma ti silulukat a lubong (RC-LH114-W) wenno ti naserraan a lubong (RC-LH116) iti aglawlaw ti RC Ti exciton a naikapet a pigmento nga urnos (Pigura 1, C ken D). No idilig iti 877 nm a banda ti RC-LH114-W, ti 880 nm a panagsebseb a nalabaga a panagbalbaliw ti RC-LH116 ket 3 nm (Pigura 2A). Nupay kasta, ti sirkulo nga espektro ti dikroismo ket gangani nga agpapada (Pigura 2B), a mangipakpakita a urayno adda ti nalawag a panagdumaduma ti nagbaetan dagiti silulukat ken naserraan a lubong, ti lokal nga aglawlaw dagiti BChls ket agpapada unay. Ti absorption redshift ket mabalin a resulta ti naikkat a thermal motion ken immadu a kinatalged iti closed loop (18, 19), ti panagbalbaliw ti pigment coupling a gapuanan ti closed loop (20, 21), wenno kombinasion dagitoy dua nga epekto (11).
(A) Ultraviolet/makita/asideg-inpranalabaga nga espektro ti panagsebseb, dagiti pantokna ket namarkaan kadagiti katupagda a pigmento ken na-normalize iti pantok ti BPh iti 775 nm. (B) Sirkulo a dikroismo nga espektro a na-normalize iti BChl a panagsebseb iti 805 nm. (C ken D) Napili nga espektro ti ΔA manipud kadagiti espektro ti panagsebseb a nasolbar ti oras ti RC-LH114-W a komplikado (C) ken RC-LH116 a komplikado (D). Para iti nasaysayaat a panagidilig, amin nga espektro ket na-normalize iti ∆A ti −A iti 0.2 ps. (E) Ti rate ti cytochrome c2 oxidation kalpasan ti irradiation iti kaadda ti nadumaduma a konsentrasion ti UQ2 (kitaen ti Figure S8 para iti raw data). (F) Kadagiti selula a naimula iti sidong ti nababa, kalalainganna wenno nangato ti kapigsana a lawag (10, 30 wenno 300μMm-2 s-1, agpada), dagiti protina W ken RC-L a subunit iti nadalus a komplikado ken ti naisina a membrane ratio. Ikeddeng ti lebel ti protina babaen ti SDS-polyacrylamide gel electrophoresis ken immunoassay (kitaen ti Figura S9 para iti raw data). Ikeddeng ti ratio a relatibo iti nadalus nga RC-LH114-W complex. Ti estoikiometriko a ratio ti RC-L iti protina-W ti komplikado ket 1:1.
Dagiti BChls iti posision 1 iti depormado nga αβ14 a lubong ti RC-LH114-W (Pigura 1, A, C, ken E) ket as-asideg iti RC a kangrunaan a donor (P) babaen ti 6.8Å ngem dagiti katupag a BChls iti RC-LH116 (Pigura. 1, B, D, ken F, ken Figura S3); nupay kasta, ti apagbiit a kinetika ti panagsebseb dagiti dua a komplikado ket mangipakita a para iti RC-LH114-W ken RC-LH116, dagiti konstante ti panawen ti panagiyakar ti enerhia ti panagpukaw manipud iti LH1 aginggana iti RC ket 40 ±4 ken 44±3 ps (Pigura 2). , C ken D, Ladawan S4 ken Tabla S2). Awan met ti dakkel a nagdumaan ti elektroniko a panagiyakar iti uneg ti RC (Pigura S5 ken mainaig a suplementario a teksto). Suspetsami a ti asideg a panagtunos ti panawen ti panagiyakar ti enerhia iti nagbaetan ti LH1 ken RC-P ket gapu ti kapada a distansia, anggulo ken potensial nga enerhia ti kaaduan a BChl kadagiti dua a LH1 a lubong. Kasla ti panagsukisok ti padron ti enerhia ti LH1 tapno makadanon iti kabassitan a distansia ket saan a naparpartak ngem ti direkta a panagiyakar ti enerhia manipud kadagiti suboptimal a lugar aginggana iti RC. Ti open-loop LH1 loop iti RC-LH114-W ket mabalin pay a mapasaran ti saan a napateg a termal a panaggunay iti sidong dagiti nababa a temperatura a kasasaad para iti estruktural a panaganalisar, ken adda ti at-atiddog ​​nga αβ14 a singsing a konpormasion iti temperatura ti kuarto manipud iti distansia ti pigmentasion dagiti βBChls iti posision ti RC 1.
Ti RC-LH116 a komplikado ket aglaon kadagiti 32 a BChl ken 16 a carotenoid, ken ti sapasap a pannakaurnosna ket isu met laeng ti naala manipud iti Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 a kita ( PDB ID 7C9R) (12) ken berde dagiti alga (Blc.viridis) (PDB nga ID 6ET5) (10). Kalpasan ti panagtunos, dagiti laeng babassit a panagsilpo kadagiti posision dagiti αβ a heterodimero ket napaliiw, nangruna ti 1-5, 15, ken 16 (Pigura S6). Ti kaadda ti protina-W ket addaan iti dakkel nga epekto iti estruktura ti LH1. Dagiti tallo a TMHna ket naisilpo babaen dagiti ababa a lubong, nga addaan ti N-terminal iti sikigan ti lumen ti komplikado ken ti C-terminal iti sikigan ti sitoplasmiko (Pigura 1A ken 3, A aginggana iti D). Ti protina-W ket kaaduan a hydrophobic (Pigura 3B), ken ti TMH2 ken TMH3 ket makilanglangen iti LH1αβ-14 tapno mangporma ti rabaw ti transmembrane (Pigura 3, B ken E aginggana iti G). Ti interface ket nangruna a buklen dagiti Phe, Leu ken Val a nabati iti rehion ti transmembrane. Dagitoy a nabati ket naurnong kadagiti hydrophobic nga amino acid ken αβ-14 a pigmento. Sumagmamano a polar a nabati ket makatulong pay iti panagtitinnulong, a mairaman ti hidroheno a singgalut iti nagbaetan ti W-Thr68 ken β-Trp42 iti rabaw ti komplikado a wangawangan (Pigura 3, F ken G). Iti rabaw ti sitoplasma, ti Gln34 ket kabangibang ti keto a grupo dagiti αβ-14 a karotenoid. Iti pay maipatinayon, ti molekula ti n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ket nasolbar, ken ti hydrophobic nga ipusna ket nagsaknap iti nagbaetan ti protina-W ken αβ-14, ken ti lipido nga ipus ket mabalin a mabirukan iti bagi. Nadlawmi pay a dagiti rehion ti C-terminal a resolusion ti protina W ken RCH ket asideg unay, ngem saan iti sakop ti panagporma kadagiti espesipiko a panagtitinnulong (Pigura 1, A ken E). Nupay kasta, mabalin nga adda dagiti panagtitinnulong kadagiti saan a nasolbar a C-terminal nga amino asido dagitoy dua a protina, a mabalin a mangipaay ti mekanismo para iti panagrekrut ti protina-W bayat ti panagtitipon ti RC-LH114-W a komplikado.
(A) Ti protina-W, a sumango iti interface iti LH1αβ14 iti porma ti cartoon, ket addaan iti sukog-baston a sikigan a kawar (nalabaga), a naiparang iti maysa a paset ti elektrostatiko a potensial a diagrama (transparent nga abuabu a rabaw nga addaan iti lebel ti kontur iti 0.13). (B) Protina-W nga irepresentar ti hydrophobic a namaris a rabaw. Dagiti polar ken nakargaan a lugar ket naiparang iti cyan, dagiti hydrophobic a lugar ket naiparang iti puraw, ken dagiti napigsa a hydrophobic a lugar ket naiparang iti kahel. (C ken D) Protina-W a nairepresentar iti cartoon, ti orientasionna ket isu met laeng ti (A) (C), ken naiturong babaen ti 180° (D). Segun ti posision iti panagsasaruno, dagiti mailasin a nabati ket mangampon ti eskema ti kolor ti balangaw, a ti N-terminal ket asul ken ti C-terminal ket nalabaga. (E) Protina-W iti isu met laeng a panagkita a kas iti (A), ken dagiti nabati iti nagbaetan ti protina-W:LH1 ket naibagbaga babaen dagiti baras nga addaan kadagiti naikapet a marka. (F) Ti protina-W ket naiturong iti 90° a relatibo iti (E) ken LH1αβ14 iti pannakabagi ti cartoon, ken relatibo kadagiti nabati ti interface iti pannakabagi ti bara. Dagiti agbitbitin a nabati manipud iti beta polypeptide ket naimarka. Ti cofactor ket naipakita a kas ti bara a maitunos iti kolor ti Figura 1, ti narunot a β-DDM ket naipakita iti abuabu, ken ti oksiheno ket naipakita iti nalabaga. (G) Ti buya iti (F) ket naiturong iti 180°, nga addaan kadagiti nalatak a nabati ti naimarka nga alpha polypeptide.
Ti protina-W ket mangsukat ti maysa nga αβ heterodimer (ti maika-15 iti Figura 1F), iti kasta ket manglapped ti panagserra ti loop ken mangkiling kadagiti umuna a tallo nga αβ heterodimer. Napaliiw a ti kangatuan nga anggulo ti panaginklinar ti immuna nga αβ-1 a heterodimer a relatibo iti normal a pelikula ket 25° aginggana iti 29° (Pigura 1, A ken E), a nabukel babaen ti 2° aginggana iti 8° a panaginklinar ti αβ-1 iti RC A natadem a panagdumaduma-LH116 (Pigura 1, B ken F). Ti maikadua ken maikatlo a heterodimero ket agkiling iti 12° aginggana iti 22° ken 5° aginggana iti 10°, a nagsasaruno. Gapu ti esteriko a lapped ti RC, ti panagkiling ti αβ-1 ket saan a mangiraman ti maikadua a paris ti αβ (a katupag ti maika-16 nga αβ iti Ladawan 1F), isu a mangporma ti nalawag a giwang iti singsing ti LH1 (Pigura 1, A ken E) . Gapu ti kaawan ti dua nga αβ a heterodimero, a napakuyogan ti pannakapukaw ti uppat a BChl ken dua a carotenoid, awan kadagiti carotenoid ti agsilpo iti nabalitokan nga αβ-1 a subunit, a nagbanagan ti singsing ti LH114-W a naglaon kadagiti 13 a carotenoid a Vegetariano ken 28 a BChls. Dagiti lokal a pattapatta ti resolusion dagiti dua a komplikado kadagiti rehion ti αβ1 aginggana ti 7 ket nababbaba ngem dagitoy dagiti nabati a paset ti LH1 a lubong, a mabalin a mangipakita ti nainkasigudan a plastikidad ti subunit ti LH1 a kabangibang ti lugar ti RC QB (Pigura 4) .
Dagiti ladawan ti RC-LH114-W (A ken B) ken RC-LH116 (C ken D) ket naipakita manipud iti isu met laeng a top view/side view (A ken B) (A ken C) ken cavity surface ti Fig. 1. (B ken D). Dagiti namaris a tulbek ket naipakita iti kannawan.
Ti laeng sabali pay a naisangsangayan a core complex nga addaan iti estoikiometriko a ratio iti 1:14 ket ti Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Nupay kasta, ti protina W ken PufX ket awan ti nalawag a homolohia, ken addaan iti naipangpangruna nga epekto kadagiti bukodda nga estruktura ti LH1. Ti PufX ket maysa a maymaysa a TMH nga addaan iti N-terminal a sitoplasmiko a dominio a makilanglangen iti sitoplasmiko a sikigan ti RC-H a subunit ( 13 ) iti posision a katupag ti Rps. palustris nga LH116αβ-16. Ti PufX ket mangpartuat ti kanal para iti panagsinnukat ti quinone/quinolone iti nagbaetan ti RC-LH1 ken ti cytochrome bcl complex ken adda kadagiti amin nga Rba. sphaeroides core komplikado (13). Urayno ti monomero-monomero a nagbaetan ket adda iti Rba. Ti sphaeroides RC-LH1-PufX dimer ket mabirukan iti posision ti panagsilpo ti protina W iti RC-LH114-W, ken ti giwang a naiduron babaen ti PufX ken protina-W ket adda iti katupag a posision (Pigura S7A). Ti giwang iti RC-LH114-W ket naitunos pay iti hipotetiko a kanal ti quinone (8) ti Pseudomonas rosea LH1, a naporma babaen dagiti peptido a saan a mainaig iti protina W wenno PufX (Pigura S7B). Mainayon pay, ti quinone channel iti Blc. Ti berde nga esmeralda nga LH1 a nabukel babaen ti panangilaksid ti maysa a γ a subunit (7) ket mabirukan iti kapada a posision (Pigura S7C). Urayno naipamaysa babaen dagiti nadumaduma a protina, ti panagparang dagitoy a kanal ti kinone/quinolol iti gagangay a posision iti RC-LH1 a komplikado ket kasla maysa a pagarigan ti agtitipon nga ebolusion, a mangipakpakita a ti giwang a pinartuat babaen ti protina W ket mabalin nga agtignay a kas ti kanal ti kinone.
Ti giwang iti LH114-W a lubong ket mangipalubos ti pannakaporma ti agtultuloy a rehion ti membrana iti nagbaetan ti akin-uneg nga espasio ti RC-LH114-W a komplikado ken ti bulk a membrane (Pigura 1G), imbes a mangisilpo kadagiti dua a dominio babaen ti maysa a protina a pores a kas kadagiti protina. Ti RC-LH116 complex ket kapada ti naserraan a Tch. Kasla dagum a komplikado (22) (Pigura 1H). Gapu ta ti panagsaknap ti kinone babaen ti membrane ket naparpartak ngem ti panagsaknap babaen ti akikid a kanal ti protina, ti silulukat nga LH114-W a lubong ket mabalin a mangipalubos ti naparpartak a panagbalbaliw ti RC ngem ti naserraan nga LH116 a lubong, ken ti panagsaknap ti kinona iti RC ket mabalin nga ad-adda a nainget. Tapno masubok no ti protina W ket apektaranna ti panagbalbaliw dagiti quinones babaen ti RC, inaramidmi ti cytochrome oxidation assay iti maysa a naikeddeng a konsentrasion ti ubiquinone 2 (UQ2) (maysa nga analogo ti natural nga UQ10 nga addaan iti ab-ababa nga ipus ti isoprene) (Pigura 2E). Urayno ti kaadda ti chelated a quinone ket manglapped ti umiso a panangikeddeng ti agparang a Michaelis a konstante (ti RC-LH114-W ken RC-LH116 ket maibagay para iti 0.2±0.1μM ken 0.5±0.2μM, a nagsasaruno), ti kangatuan a rate ti RC-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ket 28±5% a dakdakkel ngem ti RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Immuna a pinattapattami a ti protina-W ket adda iti agarup a 10% ti core complex ( 16 ); ditoy, dagiti panagokupar a rate dagiti nababa a lawag, kalalainganna a lawag, ken nangato a lawag a selula ti panagdakkel ket 15±0.6%, 11±1% ken 0.9±0.5, agpada a % (Pigura 2F). Ti kuantitatibo a panagidilig ti mass spectrometry ket nangipakita a ti pannakainayon ti histidine tag ket saan a nangkissay ti relatibo a kinaadu ti protina-W no maidilig kadagiti atap a kita ti kita ( P = 0.59), isu a dagitoy a lebel ket saan nga artifact ti nabaliwan a protina-W (Pigura S10). Nupay kasta, daytoy a nababa a panagokupar ti protina-W iti RC-LH1 a komplikado ket mabalin a mangipalubos kadagiti sumagmamano nga RC nga ag-flip iti napardas a rate, iti kasta ket mangpabassit ti nabannayat a panagsinnukat ti quinone/quinolone iti RC-LH116 a komplikado. Nadlawmi a ti nangato a rate ti panagokupar ti lawag ket saan a maitunos kadagiti nabiit pay a datos ti transcriptomics, a mangipakpakita a ti pufW gene expression ket dumakkel iti sidong ti napigsa a lawag ( Figura S11 ) ( 23 ). Ti nagdumaan ti pufW a transkripsion ken ti pannakaikabil ti protina-W iti RC-LH1 a komplikado ket makariro ken mabalin a mangipakita ti komplikado a panagregulasion ti protina.
Iti RC-LH114-W, 6 a cardiolipin (CDL), 7 a phosphatidylcholine (POPC), 1 a phosphatidylglycerol (POPG) ken 29 a molekula ti β-DDM ket naituding ken naimodelo iti daytoy 6 a CDL, 24 a POPC, 2 a POPG ken 12 a βDDM. RC-LH116 (Pigura 5, A ken B). Kadagitoy dua nga estruktura, ti CDL ket gangani a mabirukan iti sitoplasmiko a sikigan ti komplikado, bayat a ti POPC, POPG ken β-DDM ket kaaduan a mabirukan iti luminal a sikigan. Dua a molekula ti lipido ken detergente ti naisina iti αβ-1 agingga iti αβ-6 a rehion ti RC-LH114-W a komplikado (Pigura 5A), ken lima ti naisina iti katupag a rehion ti RC-LH116 (Pigura 5B ). Ad-adu a lipido ti nasarakan iti sabali a bangir ti komplikado, nangruna ti CDL, a naurnong iti nagbaetan ti RC ken αβ-7 aginggana iti αβ-13 (Pigura 5, A ken B). Dagiti dadduma pay nga estruktural a nasolbar a lipido ken dagiti detergente ket mabirukan iti ruar ti singsing ti LH1, ken dagiti nasayaat a nasolbar a kawar ti asil ket agsaknap iti nagbaetan dagiti subunit ti LH1, a tentatibo a naikeddeng a kas β-DDM iti RC-LH114-W, ken naikeddeng a kas β-DDM iti RC A naglaok ti β-DDM ken POPC-LH116. Dagiti kapada a posision dagiti chelating a lipido ken dagiti detergente iti estrukturatayo ket mangipakita a dagitoy ket pisiolohikal a mainaig a pagsilpoan a lugar (Pigura S12A). Dagiti posision dagiti katupag a molekula iti Tch ket addaan met iti nasayaat a panagpapada. Naalumamay ken Trv. Dagiti kita 970 nga RC-LH1s (Pigura S12, B aginggana iti E) (9, 12) ken dagiti hidroheno-a panagsilpo a nabati ti grupo ti ulo ti lipido ket nangipakita ti medyo nasayaat a konserbasion iti panagsasaruno a panagitunos (Pigura S13), a mangipakpakita a ti Napreserba a CDL a mangisilpo iti RC (24), dagitoy a lugar ket mabalin a makonserba iti RC-LH1 a komplikado.
(A ken B) Dagiti RC-LH114-W (A) ken RC-LH116 (B) a peptido ket naibagbaga babaen dagiti cartoon, ken dagiti pigmento ket naibagbaga babaen dagiti barayuboy, nga agus-usar ti eskema ti kolor iti Figura 1. Dagiti lipido ket naipakita iti nalabaga, ken dagiti detergente ket naipakita iti abuabu. Ti UQ a ​​naisinggalut kadagiti RC QA ken QB sites ket duyaw, bayat a ti naisina nga UQ ket asul. (C ken D) Kasta met laeng ti panangmatmat a kas iti (A) ken (B), a naikkat dagiti lipid. (E agingga iti G) Napalawa a buya ti Q1(E), Q2(F) ken Q3(G) manipud iti RC-LH116, nga addaan kadagiti kawar iti sikigan a mangimpluensia iti tunggal maysa. Dagiti singgalut ti hidrohena ket naipakita a kas dagiti nangisit a nagtimbukel a linia.
Iti RC-LH116, agpada ti RC QA ken QB UQ, a makipaset iti panagiyakar ti elektron iti proseso ti panagsisina ti karga, ket marunot kadagiti pagsilpoanda a lugar. Nupay kasta, iti RC-LH114-W, saan pay a nasolbar ti QB quinone ken detalyado a mailawlawag iti baba. Iti pay maipatinayon kadagiti QA ken QB a quinones, dagiti dua a chelated nga UQ a ​​molekula (mabirukan iti nagbaetan dagiti singsing ti RC ken LH1) ket naituding iti estruktura ti RC-LH114-W segun kadagiti nasayaat a nasolbar a grupo ti uloda (mabirukan iti Q1 ken Q2, a nagsasaruno). espasio). Ladawan 5C). Dua a yunit ti isoprene ti naituding iti Q1, ken ti mapa ti densidad ket mangrisut kadagiti kompleto a 10 nga ipus ti isoprene ti Q2. Iti estruktura ti RC-LH116, tallo a chelated nga UQ10 a molekula (Q1 aginggana iti Q3, Figura 5D) ket nasolbar, ken amin a molekula ket addaan iti nalawag a densidad iti intero nga ipus (Pigura 5, D aginggana iti G). Iti dua nga estruktura, dagiti posision dagiti grupo ti ulo ti quinone ti Q1 ken Q2 ket addaan iti nasayaat a panagpapada (Pigura S12F), ken dagitoy ket makilanglangen laeng iti RC. Ti Q1 ket mabirukan iti pagserkan ti W a giwang ti RC-LH114-W (Pigura 1G ken 5, C, D ken E), ken ti Q2 ket mabirukan iti asideg ti QB a pagsilpoan a lugar (Pigura 5, C, D) ken F). Dagiti napreserba a L-Trp143 ken L-Trp269 a nabati ket asideg unay iti Q1 ken Q2 ken mangipaay kadagiti potensial a π-panagtumpok a panagtitinnulong (Pigura 5, E ken F, ken Pigura S12). Ti L-Gln88, 3.0 Å manipud iti distal nga oksiheno ti Q1, ket mangipaay ti napigsa a hidroheno a singgalut (Pigura 5E); daytoy a nabati ket napreserba kadagiti amin nga RC malaksid ti kaadaywan a relasion (Pigura S13). Ti L-Ser91 ket konserbatibo a nasukatan para iti Thr kadagiti kaaduan a sabali nga RC (Pigura S13), ket 3.8 Angstrom manipud iti metil oksiheno ti Q1, ken mabalin a mangipaay kadagiti nakapuy a singgalut ti hidroheno (Pigura 5E). Ti Q3 ket saan nga agparang nga addaan iti espesipiko a panagtitinnulong, ngem mabirukan iti hydrophobic a rehion iti nagbaetan ti RC-M a subunit ken ti LH1-α a subunit 5 aginggana ti 6 (Pigura 5, D ken G). Ti Q1, Q2 ken Q3 wenno dagiti asideg a chelated quinones ket nasolbar metten iti Tch. Naalumamay, Trv. Usaren ti 970 ken Blc. Ti estruktura ti iris (9, 10, 12) ket mangitudo ti napreserba a katulongan a quinone a pagsilpoan a lugar iti RC-LH1 a komplikado (Pigura S12G). Dagiti lima a narunot nga UQ iti RC-LH116 ket nasayaat ti panagtunosda iti 5.8±0.7 ti tunggal maysa a komplikado a naikeddeng babaen ti nangato a panagaramid a likido a kromatograpia (HPLC), bayat a dagiti tallo a narunot nga UQ iti RC-LH114-W ket nababbaba ngem Ti nasukatan a pateg ti 6.2±0.3 (Fig. S14) ket mangipakita nga adda dagiti saan a nasolbar a molekula ti UQ iti estruktura.
Dagiti pseudo-simetriko nga L ken M a polipeptido ket tunggal maysa ket aglaon kadagiti lima a TMH ken mangporma ti heterodimero a mangtipon ti maysa a BChl dimer, dua a BChl a monomero, dua a bacteriophage (BPh) a monomero, ken maysa a saan a Heme a landok ken maysa wenno dua a molekula ti UQ10. Babaen ti kaadda dagiti singgalut ti hidroheno iti terminal a grupo ti ketone ken ti ammo a panagurnongna kadagiti Rps, dagiti karotenoid ket naikabilda iti M-subunit, a napanaganan iti cis-3,4-dehydroorhodopin. Sebbangan (25). Ti akinruar a dominio ti membrane ti RC-H ket naisanglad iti membrane babaen ti maymaysa a TMH. Ti sapasap nga estruktura ti RC ket kapada ti tallo a subunit nga RC dagiti mainaig a sebbangan (kas ti Rba). dagiti esferoide (PDB ID: 3I4D). Dagiti makrosiklo ti BChl ken BPh, ti carotenoid a duri ken saan a heme a landok ket agtuon iti uneg ti sakop ti resolusion dagitoy nga estruktura, a kas ti ar-aramiden ti grupo ti ulo ti UQ10 iti lugar ti QA ken ti QB quinone iti RC-LH116 (Pigura S15).
Ti kaadda ti dua nga estruktura ti RC nga addaan kadagiti nadumaduma a QB site occupancy rates ket mangipaay ti baro a gundaway a mangsukimat kadagiti agtultuloy a panagbalbaliw ti konpormasion a kakuykuyog ti QB quinone binding. Iti RC-LH116 complex, ti QB quinone ket mabirukan iti naan-anay a naisinggalut a “proximal” a posision ( 26 ), ngem ti panagsina ti RC-LH114-W ket awan ti QB quinone. Awan ti QB quinone iti RC-LH114-W, a nakaskasdaaw gapu ta aktibo ti komplikado, ad-adda ngem ti RC-LH116 complex nga addaan iti estruktural a nasolbar a QB quinone. Urayno dagiti dua a singsing ti LH1 ket ag-chelate kadagiti agarup nga innem a quinones, lima ket estruktural a nasolbar iti naserraan a singsing ti RC-LH116, bayat a tallo laeng ti estruktural a limitado iti silulukat a singsing ti RC-LH114-W . Daytoy nga immadu nga estruktural a pannakariribuk ket mabalin a mangipakita ti naparpartak a pannakasukat dagiti lugar ti RC-LH114-W QB, naparpartak a kinetika ti kinone iti komplikado, ken immadu a posibilidad a bumallasiw iti LH1 a lubong. Isingasingmi a ti kaawan ti UQ iti RC QB a lugar ti RC-LH114-W ket mabalin a resulta ti mas komplikado ken ad-adda nga aktibo a komplikado, ken ti QB a lugar ti RC-LH114-W ket dagus a nagyelo iti panagbalbaliw ti UQ Ti espesipiko a tukad (ti pagserkan iti QB a lugar ket naserraan) ket mangipakita ti konpormasion daytoy nga aktibidad.
No awan ti QB, ti kakuykuyog a panagrikus ti L-Phe217 iti posision a saan a maitunos iti panagsilpo ti UQ10, gapu ta daytoy ket mangpataudto ti espasial a panagdinnungpar iti umuna nga isoprene a yunit ti ipus (Pigura 6A). Iti pay maipatinayon, dagiti nalawag a kangrunaan a panagbalbaliw ti konpormasion ket nalawag, nangruna ti helix de (ababa a helix iti lubong iti nagbaetan ti TMH D ken E) a sadiay ti L-Phe217 ket naibalbaliw iti bulsa ti panagsilpo ti QB ken ti panagrikus ti L-Tyr223 (Pigura 6A ) Tapno maburak ti hidroheno a singgalut iti balangkas ti M-Asp45 ken iserrana ti pagserkan ti lugar ti panagsilpo ti QB (Pigura 6B). Ti Helix de pivots iti batayanna, ti Cα ti L-Ser209 ket naibalbaliw babaen ti 0.33Å, bayat a ti L-Val221Cα ket naibalbaliw babaen ti 3.52Å. Awan dagiti mapaliiw a panagbalbaliw iti TMH D ken E, a mai-superimposable iti agpada nga estruktura (Pigura 6A). Agingga iti ammotayo, daytoy ti umuna nga estruktura iti natural nga RC a mangiserra iti QB site. Ti panagidilig iti kompleto (QB-naisinggalut) nga estruktura ket mangipakita a sakbay a ti kinona ket makissayan, ti panagbalbaliw ti konpormasion ket kasapulan tapno makastrek daytoy iti kinona. Ti L-Phe217 ket agturong tapno mangporma ti π-a panagtumpok a panagtitinnulong iti grupo ti ulo ti quinone, ken ti helix ket ag-shift nga agparuar, a mangipalubos ti iskeleton ti L-Gly222 ken ti sikigan a kawar ti L-Tyr223 a mangporma ti network ti hidroheno a singgalut nga addaan iti natalinaay nga estruktura ti singgalut ti hidrohena (Pigura 6, A ken C).
(A) Agtupak a cartoon ti hologram (L kadena, kahel/M a kadena, magenta) ken apo (abuabu) nga estruktura, a dagiti kangrunaan a nabati ket maiparang iti porma ti kasla barayuboy a pannakabagi. Ti UQ10 ket irepresentar babaen ti duyaw a bara. Ti tulnek a linia ipamatmatna dagiti singgalut ti hidrohena a nabukel iti intero nga estruktura. (B ken C) Ti rabaw a pannakabagi ti apolipoprotina ken ti sibubukel nga estruktura ti singsing, a mangitag-ay ti oksiheno ti sikigan a kadena ti L-Phe217 iti asul ken L-Tyr223 iti nalabaga, a nagsasaruno. Ti L subunit ket kahel; dagiti M ken H a subunit ket saan a namaris. (D ken E) Apolipoprotein (D) ken sibubukel (E) nga RC QB sites [kolor babaen ti (A) agpada] ken Thermophilus thermophilus PSII (berde, asul nga addaan plastik a quinone; PDB ID: 3WU2) Itunos (58).
Di ninamnama, urayno dagiti sumagmamano nga estruktura dagiti QB-a-kurang nga RC nga awan ti LH1 ket magun-od, dagiti panagbalbaliw ti konpormasion a napaliiw iti daytoy a panagadal ket saan pay a dati a naipadamag. Karaman kadagitoy ti QB depletion structure manipud iti Blc. viridis (ID ti PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ken Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), amin dagitoy ket dandani kapada ti pakabuklan nga estruktura ti QB-da. Ti nasinged a panangsukimat iti 3PRC ket nangipalgak a dagiti molekula ti detergente ti LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ket agsilpo iti pagserkan ti posision ti QB, a mabalin a manglapped ti panagurnos manen iti naserraan a konpormasion. Urayno ti LDAO ket saan a marunot iti isu met laeng a posision iti 1EYS wenno 1OGV, dagitoy nga RC ket naisagana babaen ti panagusar ti isu met laeng a detergente ken gapuna ket mabalin a mangpataud ti isu met laeng nga epekto. Ti kristal nga estruktura ti Rba. Ti Sphaeroides RC a co-crystallized iti cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) ket kasla met addaan iti naserraan a QB a lugar. Nupay kasta, iti daytoy a kaso, ti N-terminal a rehion ti RC-M a polipeptido (a makilanglangen iti QB a pagsilpoan a lugar babaen ti H a singgalut ti Tyr a nabati iti Q a helix) ket mangampon ti saan a natural a konpormasion, ken ti QB a panagbalbaliw ti konpormasion ket saan pay a nasuksukisok ( 30 ). Ti makapatalged ket saanmi a nakita daytoy a kita ti panagporma ti M a polipeptido iti estruktura ti RC-LH114-W, a gangani a kapada ti N-terminal a rehion ti RC-LH116 RC. Nasken pay a maipalagip a kalpasan ti pannakapukaw ti detergent-based LH1 antenna, dagiti apolipoprotein RC iti PDB ket nasolbar, a nangikkat kadagiti akin-uneg a quinone pools ken lipids iti giwang iti nagbaetan ti RC ken ti akin-uneg a rabaw ti aglawlaw a singsing ti LH1 ( 31 , 32 ). Agtalinaed nga agtigtignay ti RC gapu ta pagtalinaedenna amin a cofactor, malaksid iti marunot a QB quinone, a saan unay a natalged ken masansan a mapukaw bayat ti proseso ti panagsagana ( 33 ). Iti pay maipatinayon, ammo a ti pannakaikkat ti LH1 ken dagiti natural a sikliko a lipido manipud iti RC ket mabalin nga addaan iti epekto kadagiti panagandar, a kas ti napaababa a panagbiag ti karga-a-naisina a P+QB-a kasasaad ( 31 , 34 , 35 ). Gapuna, pattapattaenmi a ti kaadda ti lokal a singsing ti LH1 a nanglikmut iti RC ket mabalin a mangtaginayon ti “naserraan” a lugar ti QB, iti kasta ket maipreserba ti lokal nga aglawlaw iti asideg ti QB.
Urayno ti apolipoprotina (awan ti QB quinone) ken ti kompleto nga estruktura ket mangibagi laeng ti dua a snapshot ti panagbalbaliw ti lugar ti QB, imbes a dagiti serye dagiti pasamak, adda dagiti pakakitaan a ti panagsilpo ket mabalin a mai-gated tapno malapdan ti panagsilpo manen babaen ti hidroquinone Tapno malapdan ti pananglapped ti substrato. Ti panagtitinnulong ti quinolol ken quinone iti asideg ti QB a lugar ti apolipoprotein ket mabalin a naiduma, a mangiturong iti pannakailaksidna babaen ti RC. Nabayagen a naisingasing a dagiti panagbalbaliw ti konpormasion ket addaan iti papel iti panagsilpo ken panagpabassit dagiti quinone. Ti abilidad dagiti nagyelo nga RC a mangkissay kadagiti quinones kalpasan ti nasipnget a panagadaptasion ket nadadael (36); Ipakita ti X-ray crystallography a daytoy a pannakadadael ket gapu kadagiti QB quinones a naibalud iti “distal” a konpormasion iti agarup a 4.5 Å manipud iti aktibo a proximal a posision (26) , 37). Isingasingmi a daytoy a distal a panagsilpo a konpormasion ket maysa a ladawan ti tengnga a kasasaad iti nagbaetan ti apolipoprotina ken ti naan-anay nga estruktura ti singsing, a mangsurot ti damo a panagtitinnulong iti kinone ken ti panaglukat ti lugar ti QB.
Ti tipo II nga RC a nasarakan iti PSII a komplikado ti sumagmamano a pototropiko a bakteria ken cyanobacteria, algae ken mula ket addaan iti estruktural ken panagandar a konserbasion ( 38 ). Ti estruktural a panagtunos a naipakita iti Figura 6 (D ken E) ket mangipaganetget ti panagpapada ti nagbaetan dagiti PSII RC ken ti QB a lugar ti bakteria nga RC a komplikado. Daytoy a panagidilig ket nabayagen a modelo para iti panagadal kadagiti asideg a nainaig a sistema ti panagsilpo ken panagpabassit ti quinone. Dagiti napalabas a publikasion ket nangisingasing a dagiti panagbalbaliw ti konpormasion ket nabuyogan babaen ti PSII a panagpabassit kadagiti quinones ( 39 , 40 ). Gapuna, no maikonsidera ti ebolusionario a konserbasion ti RC, daytoy a dati a saan a napaliiw a mekanismo ti panagsilpo ket mabalin pay a maipakat iti QB a lugar ti PSII RC kadagiti oksihena a pototropiko a mula.
Dagiti kita ti Rps ΔpufW (saan a naimarka a pufW a pannakaikkat) ken PufW-His (C-terminal 10x His-naimarka a protina-W a naiyebkas manipud iti natural a pufW a lokus). palustris CGA009 ket nailadawan iti napalabas nga obrami ( 16 ). Dagitoy a kita ken ti isogenic wild-type parent ket naala manipud iti freezer babaen ti panag-streak iti bassit a bilang dagiti selula iti PYE (tunggal maysa 5 g litro -1) (naidulin iti LB iti -80 °C, a naglaon iti 50% ( w/v) glycerol) a protina, yeast extract ken succinate) agar [1.5% (w/v)] plate. Ti plato ket naipatakder iti maysa a rabii iti nasipnget iti temperatura ti siled iti sidong dagiti anaerobiko a kasasaad, ken kalpasanna nasilawan babaen ti puraw a lawag (~50 μmolm-2 s-1) nga inted babaen dagiti OSRAM 116-W a halogen bulbs (RS Components, UK) iti las-ud ti 3 aginggana ti 5 nga aldaw aginggana idi nagparang ti maymaysa a kolonia. Maymaysa a kolonia ti nausar a mangibakuna iti 10 ml ti M22+ medium (41) a nainayon iti 0.1% (w/v) a casamino acids (manipud ditoy ket maawagan iti M22). Ti kultura ket naimula iti sidong dagiti nababa a kasasaad ti oksihena iti nasipnget iti 34°C nga addaan iti panagkintayeg iti 180 rpm iti las-ud ti 48 nga oras, ken kalpasanna ti 70 ml ti kultura ket nai-inokulado iti sidong dagiti isu met laeng a kasasaad iti las-ud ti 24 nga oras. Ti semi-aerobic a kultura nga addaan iti tomo a 1 ml ket maus-usar a mangibakuna iti 30 ml ti M22 a medium iti 30 ml nga unibersal a screw-top a transparent a sarming a botelia ken mai-iradiated babaen ti panagriribuk (~50μmolm-2 s-1) iti las-ud ti 48 nga oras babaen ti esterilisado a magnetiko a puersa Stirring rod. Kalpasanna ti 30 ml ti kultura ket na-inokulado iti agarup a 1 a litro ti kultura iti sidong dagiti isu met laeng a kasasaad, a kalpasanna ket naus-usar a mangibakuna iti agarup a 9 a litro ti kultura a nasilawan iti ~200 μmolm-2 s-1 iti las-ud ti 72 nga oras. Dagiti selula ket naapit babaen ti sentripugo iti 7132 RCF iti las-ud ti 30 a minuto, nasuspenso manen iti ~10 ml ti 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ken naidulin iti -20°C aginggana a kasapulan.
Kalpasan ti pannakarunaw, inayon ti sumagmamano a kristal ti deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) ken dua a Roche holoenzyme protease inhibitor tablets (Merck, UK) kadagiti nasuspenso manen a selula. Iti 20,000 psi a French pressure cell (Aminco, E.U.A.), nasinga dagiti selula iti 8 agingga iti 12 a daras. Kalpasan ti panangikkat kadagiti saan a naburak a selula ken dagiti di matunaw a rugit babaen ti panagsentripugo iti 18,500 RCF iti 15 a minuto iti 4°C, ti membrane ket naidasig manipud iti napigmentado a lysate babaen ti panagsentripugo iti 113,000 RCF iti 2 nga oras iti 43,000°C. Ibelleng ti matunaw a paset ken suspende manen ti namaris a membrane iti 100 agingga iti 200 ml ti 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ken homogenize agingga nga awan ti makita nga aggregate. Ti naibitin a membrane ket naipatakder iti 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) a naglaon iti 2% (w/v) β-DDM iti 1 nga oras iti nasipnget iti 4°C babaen ti naalumamay a panaggudua. Kalpasanna, i-centrifuge iti 70°C tapno marunaw ti 150,000 RCF iti 4°C iti 1 nga oras tapno maikkat dagiti nabati a di matunaw.
Ti solubilizing membrane manipud iti ΔpufW a kita ket naipakat iti 50 ml a DEAE Sepharose ion exchange column nga addaan iti tallo a tomo ti adigi (CV) ti binding buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) a naglaon iti 0.03% (w / v) β-DDM]. Bugguan ti adigi babaen ti dua a CV binding buffers, ken kalpasanna bugguan ti adigi babaen ti dua a binding buffers nga addaan iti 50 mM NaCl. Ti RC-LH116 a komplikado ket na-eluted babaen ti linia a gradiente ti 150 aginggana ti 300 mM NaCl (iti binding buffer) iti 1.75 CV, ken ti nabati a binding complex ket na-eluted babaen ti binding buffer a naglaon ti 300 mM NaCl iti 0.5 CV. Urnongen ti espektro ti panagsebseb iti nagbaetan ti 250 ken 1000 nm, pagtalinaeden ti fraksion nga addaan iti absorbance ratio (A880/A280) a dakdakkel ngem 1 iti 880 aginggana iti 280 nm, mamindua a dilute daytoy iti binding buffer, ken usaren manen ti isu met laeng a pamay-an iti kolum ti DEAE On purification. Pabassiten dagiti fraction nga addaan iti A880/A280 a ratio a nangatngato ngem 1.7 ken A880/A805 a ratio a nangatngato ngem 3.0, aramiden ti maikatlo a round ti ion exchange, ken pagtalinaeden dagiti fraction nga addaan iti A880/A280 a ratio a nangatngato ngem 2.2 ken A880/A805 a ratio a nangatngato ngem 5.0. Ti paset a nadalus a komplikado ket nakonsentrar aginggana ti ~2 ml iti maysa nga Amicon 100,000 a molekular a dagsen a cut-off (MWCO) a sentripugal a pagsala (Merck, UK), ken nakargaan iti Superdex 200 16/600 a kadakkel a pannakailaksid a kolum (GE Healthcare, US) a naglaon ti 200 mM NaCl a buffer, ken kalpasanna na-eluted iti isu met laeng a buffer iti 1.5 CV. Urnongen dagiti espektro ti panagsebseb ti paset ti pannakailaksid ti kadakkel, ken konsentrar dagiti espektro ti panagsebseb nga addaan kadagiti ratio ti A880/A280 iti rabaw ti 2.4 ken dagiti ratio ti A880/A805 iti rabaw ti 5.8 aginggana iti 100 A880, ken dagus nga usaren dagitoy para iti panagsagana wenno panagidulin ti grid ti cryo-TEM Idulin iti -80°C agingga a kasapulan.
Ti solubilizing membrane manipud iti PufW-His a kita ket naipakat iti 20 ml a HisPrep FF Ni-NTA Sepharose a kolum (20 mM tris-HCl (pH 8.0) a naglaon iti 200 mM NaCl ken 0.03% (w/w)) iti IMAC buffer ( GE Healthcare). v) β-DDM nga . Ti kolum ket nabugguan babaen ti lima a CV ti IMAC buffer, ken kalpasanna babaen ti lima a CV ti IMAC buffer a naglaon ti 10 mM histidine. Ti core complex ket na-eluted manipud iti adigi babaen ti lima nga IMAC buffers a naglaon ti 100 mM histidine. Ti paset a naglaon ti RC-LH114-W a komplikado ket nakonsentrar aginggana iti ~10 ml iti napaglalaok a tangke a naikkan iti Amicon 100,000 MWCO a pagsala (Merck, UK), nabartek iti 20 a daras babaen ti binding buffer, ken kalpasanna nainayon iti 25 ml Iti DEAE Sepharose a kolum, uppat a CV a naisinggalut iti buffer ket naus-usar a nasaksakbay. Bugguan ti kolum babaen ti uppat a CV binding buffers, kalpasanna i-elute ti complex iti walo a CV iti linear gradient ti 0 agingga iti 100 mM NaCl (iti binding buffer), ken dagiti nabati nga uppat a CV a naglaon iti 100 mM binding buffer Dagiti nabati a complex ket na-elute iti sodium chloride a naitipon iti A880/A280 ratio a nangatngato ngem 2.4 ken ti Ti A880/A805 a ratio a nangatngato ngem 4.6 a paset ket nakonsentrar aginggana iti ~2 ml iti maysa nga Amicon 100,000 MWCO a sentripugal a pagsala, ken napno iti 1.5 CV IMAC a nasaksakbay Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 a kadakkel a pannakailaksid a kolum, ken kalpasanna na-eluted iti isu met laeng a buffer iti las-ud ti 1.5 CV. Urnongen dagiti espektro ti panagsebseb dagiti kadakkel-panangilaksid a fraksion ken konsentrar dagiti espektro ti panagsebseb nga addaan kadagiti ratio ti A880/A280 iti ngato ti 2.1 ken dagiti ratio ti A880/A805 iti rabaw ti 4.6 aginggana iti 100 A880, a dagus a mausar para iti panagsagana ti nagyelo a grid ti TEM wenno maidulin iti -80°C aginggana ti kasapulan.
Nausar ti Leica EM GP immersion freezer a mangisagana kadagiti nababa a temperatura a TEM grids. Ti komplikado ket nabartek iti IMAC a buffer iti A880 ti 50, ken kalpasanna ti 5μl ket naikarga iti baro a glow-discharged a QUANTIFOIL 1.2/1.3 a karbon-a-nalupkopan a gambang a silo (Agar Scientific, UK). Ipaburek ti grid iti 20°C ken 60% a relatibo a dam-eg iti 30 s, kalpasanna blot a namaga iti 3 s, ken kalpasanna iddepen daytoy iti likido nga ethane iti -176°C.
Ti datos ti RC-LH114-W a komplikado ket nairekord iti eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) babaen ti mikroskopio ti Titan Krios, nga agtartrabaho iti agparpartak a boltahe iti 300kV, nga addaan iti nominal a panagpadakkel iti 130,000× ken enerhia ti- Pilien ti giwang iti 20 eV. Ti Gatan 968 GIF Quantum nga addaan iti K2 peak detector ket naus-usar a mangirekord kadagiti ladawan iti panagbilang a wagas tapno makaurnong ti datos. Ti nakalibrado a kadakkel ti pixel ket 1.048Å, ken ti dosis a rate ket 3.83 e-Å-2s-1. Inurnongna ti pelikula iti 11 a segundo ken biningayanna iti 40 a paset. Usaren ti lugar a nakaluban iti karbon tapno maipamaysa manen ti mikroskopio, ket kalpasanna mangurnong iti tallo a pelikula iti tunggal abut. Iti dagup, 3130 a pelikula ti naurnong, nga addaan kadagiti pateg ti defocus iti nagbaetan ti -1 ken -3μm.
Ti datos para iti RC-LH116 a komplikado ket naurnong babaen ti panagusar ti isu met laeng a mikroskopio idiay Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, UK). Ti datos ket naurnong iti panagbilang a wagas nga addaan iti panagpadakkel iti 130 k, ken ti kadakkel ti pixel ket nakalibrado iti 1.065 Å nga addaan iti dosis iti 4.6 e-Å-2s-1. Nairekord ti pelikula iti 12 a segundo ken nabingbingay iti 48 a paset. Iti dagup, 3359 a pelikula ti naurnong, nga addaan kadagiti pateg ti defocus iti nagbaetan ti -1 ken -3μm.
Amin a panagproseso ti datos ket maaramid iti Relion 3.0 a tubo (42). Usaren ti Motioncorr 2 (43) tapno mailinteg ti panaggaraw ti silnag babaen ti panagtimbang ti dosis, ken kalpasanna usaren ti CTFFIND 4.1 (44) tapno maikeddeng ti parametro ti CTF (contrast transfer function). Dagiti gagangay a photomicrograph kalpasan dagitoy nga umuna a tukad ti panagproseso ket naipakita iti Figure 2. S16. Ti automatiko a plantilia ti panagpili ket napataud babaen ti manual a panagpili kadagiti agarup a 250 a pixel ti 1000 a partikula iti 250-pixel a kuadro ken awan ti reperensia a dua-dimensional (2D) a pannakaidasig, iti kasta ket mailaksid dagitoy a pannakaidasig a makasangpet ti kontaminasion ti sample wenno awan dagiti mailasin a pakabigbigan. Kalpasanna, naaramid ti automatiko a panagpili kadagiti amin a mikroretrato, ket ti RC-LH114-W ket 849,359 a partikulo, ken ti RC-LH116 a komplikado ket 476,547 a partikulo. Amin dagiti napili a partikula ket nagdalan iti dua a panagbibingayan ti saan a reperensia a 2D a panagklasipika, ken kalpasan ti tunggal maysa a panagtaray, dagiti partikula a makasabet ti lugar ti karbon, ti kontaminasion ti sample, awan dagiti nalawag a tampok wenno dagiti napigsa nga agtuon a partikula ket nailaksid, a nagresulta iti 772,033 (90.9%) ken 359,678 (75.5%) ) Dagiti partikulo ket maus-usar para iti 3D a panagklasipika ti RC-LH114-W ken RC-LH116 a nagsasaruno. Ti immuna a 3D a reperensia a modelo ket napataud babaen ti panagusar ti estokastiko a gradiente a panagbaba a pamay-an. Babaen ti panagusar ti damo a modelo a kas reperensia, dagiti napili a partikula ket naidasig kadagiti uppat a kategoria iti 3D. Babaen ti panagusar ti modelo iti daytoy a kategoria a kas maysa a reperensia, aramiden ti 3D a panagpino kadagiti partikula iti kadakkelan a kategoria, kalpasanna usaren ti damo a 15Å a nababa-a-panagsala tapno masakupan ti lugar ti solvent, manginayon ti 6 a pixel dagiti nalukneng nga igid, ken post-proseso dagiti pixel tapno mailinteg ti Gatan K2 peak Modulation transfer function ti top detector. Para iti RC-LH114-W a dataset, daytoy nga immuna a modelo ket nabaliwan babaen ti panangikkat ti napigsa a densidad kadagiti igid ti maskara (naisina manipud iti kangrunaan a komplikado a densidad iti UCSF Chimera). Dagiti nagbanagan a modelo (dagiti resolusion ti RC-LH114-W ken RC-LH116 ket 3.91 ken 4.16 Å, a nagsasaruno) ket naus-usar a kas ti reperensia para iti maikadua a panagbibingayan ti 3D a panagklasipika. Dagiti partikulo a naus-usar ket nagrupo iti damo a klase ti 3D ken awan ti napigsa a panagpapada iti kaarrubada. Agtupak wenno kaawan dagiti nalawag nga estruktural a tampok. Kalpasan ti maikadua a panagbibingayan ti 3D a panagklasipika, ti kategoria nga addaan iti kangatuan a resolusion ket napili [Para iti RC-LH114-W, ti maysa a kategoria ket 377,703 a partikula (44.5%), para iti RC-LH116, adda dagiti dua a kategoria, nga agdagup iti 260,752 a partikulo (54.7%) , Sadino nga agpapadada laeng no naitunos kalpasan ti damo a panagrikus nga addaan iti bassit a panagdumaduma]. Dagiti napili a partikulo ket maala manen iti 400-pixel a kahon ken napinpintas babaen ti 3D a panagpino. Ti maskara ti solvent ket napataud babaen ti panagusar ti rugi a 15Å a nababa a panaglabas a pagsala, 3 a pixel a panagpalawa ti mapa ken 3 a pixel a nalukneng a maskara. Babaen ti panagusar ti kada-partikulo a CTF a panagpino, kada-partikulo a panagkorehir ti panaggunay ken ti maikadua a round ti kada-partikulo a CTF a panagpino, ti 3D a panagpino, solvent masking ken post-processing ket maaramid kalpasan ti tunggal maysa nga addang tapno ad-adda a mapino ti nagbanagan a tekstura. Babaen ti panagusar ti FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) a pateg ti pannakaputed iti 0.143, dagiti resolusion dagiti maudi a modelo ti RC-LH114-W ken RC-LH116 ket 2.65 ken 2.80Å, a nagsasaruno. Ti kurba ti FSC ti maudi a modelo ket naipakita iti Figure 2. S17.
Amin a panagsasaruno ti protina ket nai-download manipud iti UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID ti UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ti UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID ti UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ti UniProt: A0A4Z9); Protina-W (PufW; ID ti UniProt: Q6N1K3). Ti SWISS-MODEL (45) ket naus-usar a mangbangon ti modelo ti homolohia ti RC, a naglaon kadagiti panagsasaruno ti protina ti RC-L, RC-M ken RC-H ken ti estruktura ti kristal ti Rba. ti sphaeroides RC ket naus-usar a kas ti plantilia (PDB ID: 5LSE) (46). Usaren ti ramit a “fit map” iti UCSF Chimera tapno maibagay ti napataud a modelo iti mapa (47), mapasayaat ti estruktura ti protina, ken cofactor [4×BChl a (nagan ti residue ti monomer library = BCL), 2×BPh a (BPH), maysa wenno dua a kita ti UQ10 (U10), maysa a non-heme iron (Fe) ken maysa a 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] usaren ti Coot (48) tapno mainayon. Gapu ta ti QAK ket saan a magun-od iti monomero a biblioteka, daytoy ket naparametrisa babaen ti panagusar ti ramit ti eLBOW iti PHENIX ( 49 ).
Sumaganad, naaramid ti LH1 subunit. Idi damo, ti automatiko a ramit ti panagbangon iti PHENIX (49) ket naus-usar tapno automatiko a mangbangon ti paset ti panagsasaruno ti LH1 babaen ti panagusar ti mapa ken dagiti panagsasaruno ti protina ti LH1-α ken LH1-β a kas input. Pilien ti kaaduan a kompleto a subunit ti LH1, i-extract daytoy ken ikarga daytoy iti Coot, manual nga inayon ti awan a panagsasaruno iti daytoy, ken manual a papintasen ti sibubukel nga estruktura sakbay nga inayon ti dua a BCls a (BCL) ken maysa nga spirilloxanthin (CRT) [segun kadagiti mainaig nga Rps Ti densidad ti LH1 complex ken ti ammo a linaon ti carotenoid. Kita (17)]. Kopiaen ti kompleto a subunit ti LH1, ken usaren ti UCSF Chimera “Docking Map Tool” tapno agsanglad iti kabangibang a saan a modelo a lugar ti densidad ti LH1, ken kalpasanna refine daytoy iti Coot; uliten ti proseso agingga nga amin a subunit ti LH1 ket naimodelo. Para iti estruktura ti RC-LH114-W, babaen ti panangala ti saan a naituding a densidad iti Coot, ti protina ket nabingbingay manipud kadagiti nabati a saan a protina a paset iti mapa ti USCF Chimera ken ti ramit ti Autobuild ket naus-usar a mangipatakder ti rugi a modelo, ken dagiti nabati a subunit (protina-W) a Panagmodelo. Iti PHENIX (49). Inayon ti ania man a kurang a panagsasaruno iti nagbanagan a modelo iti Coot (48), ken kalpasanna manual a pasayaaten ti sibubukel a subunit. Ti nabati a saan a naituding a densidad ket maibagay iti kombinasion dagiti lipido (PDB monomer library ID ti CDL = CDL, POPC = 6PL ken POPG = PGT), β-DDM a detergente (LMT) ken dagiti molekula ti UQ10 (U10). Usaren ti PHENIX optimization (49) ken manual optimization iti Coot (48) tapno maperpekto ti kompleto nga umuna a modelo agingga a dagiti estadistika ti modelo ken ti biswal a kalidad ti panagtunos ket saan a mabalin nga ad-adda a mapasayaat. Kamaudiananna, usaren ti LocScale (50) tapno patadem ti lokal a mapa, ken kalpasanna aramiden ti sumagmamano a dadduma pay a siklo ti panagmodelo ti saan a naituding a densidad ken automatiko ken manual a panagoptimisar.
Dagiti agsasaruno a peptido, cofactor ken dagiti dadduma pay a lipido ken quinones a naisanglad iti uneg dagiti bukodda a densidad ket naipakita kadagiti Pigura 1 ken 2. S18 aginggana ti S23. Ti estadistikal nga impormasion ti maudi a modelo ket naipakita iti Tabla S1.
Malaksid no naikeddeng ti sabali, dagiti espektro ti panagsebseb ti UV/Vis/NIR ket naurnong iti Cary60 nga espektrofotometro (Agilent, USA) kadagiti 1 nm nga aggigiddan manipud iti 250 nm aginggana iti 1000 nm ken ti panawen ti panagtipon iti 0.1s.
Pabassiten ti sample iti quartz cuvette nga addaan iti 2 mm a dalan agingga iti A880 ti 1, ken urnongen ti absorption spectrum iti nagbaetan ti 400 ken 1000 nm. Dagiti sirkulo a dichroiko nga espektro ket naurnong iti Jasco 810 nga espektropolarimetro (Jasco, Hapon) kadagiti 1 nm nga aggigiddan iti nagbaetan ti 400 nm ken 950 nm iti rate ti panag-scan iti 20 nm min-1.
Ti molar a koepisiente ti pannakaungaw ket naikeddeng babaen ti panangilaok ti core complex iti maysa nga A880 iti agarup a 50. Pabassiten ti 10μl a tomo iti 990μl a binding buffer wenno metanol, ken urnongen a dagus ti espektro ti panagsebseb tapno mapabassit ti panagdadael ti BChl. Ti linaon ti BChl ti tunggal maysa a sample ti metanol ket nakuenta babaen ti koepisiente ti pannakaungaw iti 771 nm ti 54.8 mM-1 cm-1, ken ti koepisiente ti pannakaungaw ket naikeddeng ( 51 ). Biningay ti nasukatan a konsentrasion ti BChl babaen ti 32 (RC-LH114-W) wenno 36 (RC-LH116) tapno maikeddeng ti konsentrasion ti core complex, a kalpasanna mausar a mangikeddeng ti absorption spectrum ti isu met laeng a sample a naurnong iti buffer Extinction coefficient. parallel. Tallo a maulit-ulit a panagrukod ti naala para iti tunggal maysa a sample, ken ti promedio a panagsebseb ti BChl Qy maximum ket naus-usar para iti panagkarkulo. Ti koepisiente ti pannakaungaw ti RC-LH114-W a narukod iti 878 nm ket 3280±140 mM-1 cm-1, bayat a ti koepisiente ti pannakaungaw ti RC-LH116 a narukod iti 880 nm ket 3800±30 mM-1 cm-1.
Ti UQ10 ket nakuantipikar segun ti pamay-an iti (52). Iti ababa a pannao, naaramid ti reverse phase HPLC (RP-HPLC) babaen ti Agilent 1200 HPLC system. Runawen ti agarup a 0.02 nmol ti RC-LH116 wenno RC-LH114-W iti 50μl ti 50:50 methanol:chloroform nga addaan iti 0.02% (w/v) a ferric chloride, ken i-inject ti nasakbay a natimbeng a Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm Runawen iti 1 ml-1 min-1 iti 40°C iti HPLC solvent (80:20 metanol:2-propanol) iti ×25 cm nga adigi. Mangaramid ti isocratic elution iti HPLC solvent tapno mamonitor ti absorbance iti 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) ken 780 nm (BChl) iti 1 nga oras. Ti pantok iti 275 nm a kromatogram iti 25.5 a minuto ket naikaykaysa, nga awan ti naglaon kadagiti ania man a sabali a mailasin a kompuesto. Ti naikaykaysa a lugar ket naus-usar a mangkuenta ti molar a kaadu ti UQ10 a naala babaen ti panangitudo iti kurba ti kalibrasion a nakuenta manipud iti panangineksion kadagiti puro a pagalagadan manipud iti 0 aginggana iti 5.8 nmol (Pigura S14). Tunggal sample ket naanalisar iti tallo a replika, ken ti naipadamag a biddut ket katupag ti SD ti promedio.
Ti solusion a naglaon ti RC-LH1 a komplikado nga addaan iti kangatuan a Qy a panagsebseb iti 0.1 ket naisagana babaen ti 30 μM a naikkat a puso ti kabalio a cytochrome c2 (Merck, UK) ken 0 aginggana ti 50 μMUQ2 (Merck, UK). Tallo a 1-ml a sample ti naisagana iti tunggal konsentrasion ti UQ2 ken naipatakder iti maysa a rabii iti nasipnget iti 4°C tapno masigurado ti naan-anay a panagadaptasion iti nasipnget sakbay ti panagrukod. Ti solusion ket naikarga iti OLIS RSM1000 modular spectrophotometer a naikkan iti 300 nm a gil-ayab/500 a linia a grating, 1.24 mm a sumrek, 0.12 mm a tengnga ken 0.6 mm a pagruaran a slit. Ti 600 nm long pass filter ket naikabil iti pagserkan ti sample phototube ken ti reperensia a photomultiplier tube tapno mailaksid ti excitation light. Ti absorbance ket namonitor iti 550 nm nga addaan iti oras ti panagtipon iti 0.15 s. Ti lawag ti panagpukaw ket mairuar manipud iti 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) babaen ti fiber optic cable iti 90% a kapigsa babaen ti DC2200 controller (Thorlabs Ltd., UK) ken mairuar iti gubuayan ti lawag iti anggulo a 90° ti. Ti pagrukod a silnag ket maikontra iti sarming tapno agsubli ti aniaman a lawag a saan idi damo a naagsep ti sample. Imonitor ti absorbance 10 s sakbay ti illuminance ti 50 s. Kalpasanna ti panagsebseb ket ad-adda pay a namonitor iti 60 s iti nasipnget tapno matingiting ti saklaw a ti quinolol ket espontaneo a mangkissay ti cytochrome c23 + (kitaen ti Figura S8 para iti raw a datos).
Ti datos ket naproseso babaen ti panangikapet ti linia nga umuna a rate iti uneg ti 0.5 aginggana ti 10 s (depende iti konsentrasion ti UQ2) ken panagpromedio kadagiti rate ti amin a tallo a sample iti tunggal maysa a konsentrasion ti UQ2. Ti konsentrasion ti RC-LH1 a nakuenta babaen ti bukod a koepisiente ti pannakaungaw ket naus-usar a mangbalbaliw ti rate iti katalitiko nga episiensiana, a naiplano iti Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), ken naikapet iti modelo ti Michaelis-Menten tapno maikeddeng dagiti agparang a pateg ti Km ken Kcat.
Para kadagiti apagbiit a panagrukod ti panagsebseb, ti sample ti RC-LH1 ket nabartek iti ~2μM iti IMAC a buffer a naglaon iti 50 mM a sodium ascorbate (Merck, USA) ken 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Ti ascorbic acid ket maus-usar a kas ti sakripisio nga elektron a donor, ken ti tert-butaclofen ket maus-usar a kas ti QB inhibitor tapno masigurado a ti kangrunaan nga RC a donor ket agtalinaed a naikkat (kayatna a sawen, saan a photooxidized) iti intero a proseso ti panagrukod. Agarup a 3 ml ti sample ket mainayon iti kostumbre nga agturong a selula (agarup a 0.1 m ti diametro, 350 RPM) nga addaan iti 2 mm nga optiko a dalan a kaatiddog ​​tapno masigurado a ti sample iti dalan ti laser ket addaan iti umdas a panawen para iti nasipnget a panagadaptasion iti nagbaetan dagiti pulso ti panagpukaw. Usaren dagiti ~100-fs a pulso ti laser tapno mapapigsa ti sistema ti laser ti Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) tapno mapukaw ti sample iti 880 nm iti panagulit a rate iti 1 kHz (20 nJ para iti NIR wenno 100 nJ para iti Vis). Sakbay nga agkolekta ti datos, ibutaktak ti sample iti excitation light iti agarup 30 a minuto. Ti pannakaisarang ket mangpataud iti QA inactivation (mabalin a mangkissay iti QA iti maminsan wenno mamindua). Ngem pangngaasiyo ta laglagipenyo a daytoy a proseso ket mabaliwan gapu ta kalpasan ti napaut a panawen ti nasipnget a panagadaptasion, in-inut nga agsubli ti RC iti aktibidad ti QA. Ti maysa nga espektrometro ti Helios (Ultrafast Systems, USA) ket naus-usar a mangrukod kadagiti apagbiit nga espektro nga addaan iti panawen ti panagtaktak iti -10 aginggana ti 7000 ps . Usaren ti software ti Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) tapno ma-ungroup dagiti data set, kalpasanna agtipon ken ag-standardize. Usaren ti pakete ti software ti CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) tapno agusar ti naitipon a datos a grupo tapno makagun-od kadagiti naidumaduma nga espektro a mainaig iti panagrunot, wenno agusar ti maysa a panagandar a mangkonbolbar kadagiti adu nga eksponente iti sungbat ti instrumento tapno maibagay ti maymaysa-a-kaatiddog ​​ti allon nga espektral nga ebolusion iti Origin (OriginLab, USA).
Kas nadakamat iti ngato (53), naisagana ti photosynthetic film a naglaon iti LH1 complex nga agpada nga awanan iti RC ken peripheral LH2 antenna. Ti membrane ket nabartek iti 20 mM tris (pH 8.0) ken kalpasanna naikarga iti quartz cuvette nga addaan iti 2 mm nga optiko a dalan. Ti 30nJ a pulso ti laser ket naus-usar a mangpukaw ti sample iti 540 nm nga addaan iti panawen ti panagtaktak iti -10 aginggana ti 7000 ps. Iproseso ti data set kas nailadawan para iti Rps. pal sample.
Ti membrane ket na-pellet babaen ti sentripugo iti 150,000 RCF iti 2 nga oras iti 4°C, ken kalpasanna ti panagsebsebna iti 880 nm ket nasuspenso manen iti 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ken 200 mM NaCl. Runawen ti membrane babaen ti in-inut a panangkiwar iti 2% (w/v) a β-DDM iti 1 nga oras iti nasipnget iti 4°C. Ti sample ket nabartek iti 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) iti konsentrasion ti protina iti 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis). Ti kanayonan a panagproseso ket naaramid manipud iti dati a naipablaak a pamay-an (54), a nangrugi iti pannakarunaw ti 50 μg a protina iti dagup a 50 μl a TEAB a naglaon iti 1% (w/v) a sodium laurate (Merck, UK). Kalpasan ti sonication iti 60 s, daytoy ket naikkat babaen ti 5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (Merck, UK) iti 37 ° C iti 30 a minuto. Para iti S-alkylation, ipaburek ti sample iti 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ken inayon daytoy manipud iti 200 mM isopropanol stock solution iti 10 a minuto iti temperatura ti siled. Ti proteolitiko a panagrunaw ket naaramid babaen ti pananginayon ti 2 μg a trypsin/endoproteinase Lys-C a naglaok (Promega UK) ken naipatakder iti 37°C iti las-ud ti 3 nga oras. Ti laurate surfactant ket naala babaen ti pananginayon ti 50 μl nga ethyl acetate ken 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ken panag-vortex iti 60 s. Ti panagsina ti paset ket naitandudo babaen ti sentripugo iti 15,700 RCF iti 5 a minuto. Sigun iti protocol ti managaramid, nausar ti C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) a siaannad a mang-aspirate ken mangikkat iti asin iti nababbaba a paset a naglaon iti peptide. Kalpasan ti panagmaga babaen ti vacuum centrifugation, ti sample ket narunaw iti 0.5% TFA ken 3% nga acetonitrile, ken ti 500 ng ket naanalisar babaen ti nanoflow RP chromatography a naikuyog iti mass spectrometry babaen ti panagusar kadagiti parametro ti sistema a naidetalye iti napalabas.
Usaren ti MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para iti pannakailasin ti protina ken panagkuantipika tapno agsapul iti Rps. database ti proteoma ti palustris (www.uniprot.org/proteomas/UP000001426). Ti datos ti proteomika ti espektrometria ti masa ket naideposito idiay ProteomeXchange Alliance babaen ti PRIDE a kasosio a pagidulinan (http://proteomecentral.proteomexchange.org) iti baba ti dataset a pakabigbigan a PXD020402.
Para iti panaganalisar babaen ti RPLC a naikuyog iti electrospray ionization mass spectrometry, ti RC-LH1 a komplikado ket naisagana manipud kadagiti atap a tipo nga Rps. Babaen ti panagusar ti dati a naipablaak a pamay-an (16), ti konsentrasion ti protina a napataud kadagiti selula ti palustris ket 2 mg ml-1 iti 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl ken 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM. Segun iti protocol ti agpatpataud, agusar iti 2D purification kit (GE Healthcare, USA) tapno makaala iti 10 μg a protina babaen ti pamay-an ti panagtudo, ken marunaw ti natudo iti 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile ken 20% (v/v) a danum. Lima a mikrolitro ti naanalisar babaen ti RPLC (Dionex RSLC) a naikuyog iti mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Usaren ti MabPac 1.2×100 mm a kolum (Thermo Fisher Scientific, UK) para iti panagsina iti 60°C ken 100μlmin -1, nga addaan iti gradient a 85% (v / v) a solvent A [0.1% (v / v) FA ken 0.02% (V/v) TFA a nadalusan a solusion] agingga iti 85%(v/v) a solvent B [0.1%(v/v) FA ken 0.02%(v/v) iti 90%(v/v) acetonitrile TFA] Babaen ti panagusar ti gagangay a taudan ti ionisasion ti elektrospray ken dagiti default a parametro iti nasurok a 60 a minuto, ti espektrometro ti masa ket makagun-od ti 100 aginggana ti 2750 m/z (masa-iti-karga a ratio). Babaen ti tulong ti ExPASy bioinformatics resource portal FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), i-map ti espektro ti masa kadagiti subunit ti komplikado.
Dagiti selula ket naipadakkel iti 72 nga oras iti sidong ti 100 ml nga NF-nababa (10μMm-2 s-1), kalalainganna (30μMm-2 s-1) wenno nangato (300μMm-2 s-1) a lawag. M22 medium (M22 medium a ti ammonium sulfate ket naikkat ken ti sodium succinate ket nasukatan babaen ti sodium acetate) iti 100 ml a botelia ti tornilio-top (23). Iti lima a 30-s a siklo, dagiti 0.1 micron a sarming a kuwintas ket na-beaded iti volume ratio a 1:1 tapno lyse dagiti selula ken nalamiis iti yelo iti 5 a minuto. Ti di matunaw a banag, dagiti saan a naburak a selula ken dagiti kuwintas ti sarming ket naikkat babaen ti centrifugation iti 16,000 RCF iti las-ud ti 10 a minuto iti benchtop microcentrifuge. Ti membrane ket naisina iti Ti 70.1 a rotor nga addaan iti 100,000 RCF iti 20 mM tris-HCl (pH 8.0) nga addaan iti 40/15% (w/w) a sucrose gradient iti las-ud ti 10 nga oras.
Kas nailadawan iti napalabas nga obrami, immunodetection ti His tag iti PufW ( 16 ). Iti ababa a pannao, ti nadalus a core complex (11.8 nM) wenno ti membrane a naglaon ti isu met laeng a konsentrasion ti RC (naikeddeng babaen ti oksidasion a mangikkat ti naikkat a panagdumaduma nga espektro ken panagtunos ti karga iti namantsaan a gel) iti 2x SDS loading buffer (Merck, UK) a nabartek iti mamindua. Dagiti protina ket naisina iti replika a 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Maysa a gel ti namantsaan iti Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) tapno maikarga ken mailadawan ti RC-L subunit. Ti protina iti maikadua a gel ket nayakar iti methanol-activated polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, UK) para iti immunoassay. Ti PVDF a membrane ket nabara iti 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 ken 5% (w / v) a nalukmeg a pulbos ti gatas, ken kalpasanna naipatakder iti anti-His a kangrunaan nga antibody (iti Dilute ti antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl ken 0.05% (v/v) Tween-20] iti 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, E.U.A.) iti las-ud ti 4 nga oras. Kalpasan ti panagbuggo iti 3 a daras iti 5 a minuto iti antibody buffer, ti membrane ket naitipon iti horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (nabartek iti 1:10,000 iti antibody buffer) I-incubate tapno maipalubos ti pannakaduktal (5 a minuto kalpasan ti 3 a panagbuggo iti antibody buffer) babaen ti panagusar ti WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italia) ken Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Babaen ti panangidrowing ti pannakaiwaras ti kapigsa ti tunggal maysa a namantsaan a gel wenno immunoassay a lane, panangitipon ti lugar iti baba ti pantok ken panangkuenta ti kapigsa a ratio ti RC-L (namantsa a gel) ken Protina-W (immunoassay), iti ImageJ (57) Iproseso ti ladawan. Dagitoy a ratio ket nabaliwan kadagiti molar a ratio babaen ti panangipapan a ti ratio ti RC-L iti protina-W iti puro a sample ti RC-LH114-W ket 1:1 ken panagnormalisar ti sibubukel a datos a naikeddeng a maitunos.
Para kadagiti suplementario a materiales para iti daytoy nga artikulo, pangngaasi a kitaen ti http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Daytoy ket maysa nga artikulo ti silulukat a panagserrek a naiwarwaras babaen dagiti kondision ti Lisensia ti Panagpabigbig ti Creative Commons. Ti artikulo ket mangipalubos ti saan a nainget a panagusar, panagiwaras, ken panagpaadu iti ania man a medium iti sidong ti kondision a ti orihinal nga obra ket umiso a nadakamat.
Pakaammo: Kiddawenmi laeng nga itedmo ti email address-mo tapno ammo ti tao nga irekomendarmo iti panid a kayatmo a makitada ti email ken saan nga spam dayta. Saanmi a matiliw ti aniaman nga email address.
Daytoy a saludsod ket mausar a mangsubok no maysaka a bisita ken manglapped iti automatiko a panagipatulod ti spam.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Mannalon, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ti nangato a resolusion nga estruktura ti light trap 1 complex iti sentro ti reaksion ket mangipaay kadagiti baro a pannakaammo iti dinamika ti quinone.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Mannalon, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Ti nangato a resolusion nga estruktura ti light trap 1 complex iti sentro ti reaksion ket mangipaay kadagiti baro a pannakaammo iti dinamika ti quinone.
©2021 Kappon ti Amerikano para iti Panagrang-ay ti Siensia. amin a karbengan ket naisagana. Ti AAAS ket kasosio ti HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ken COUNTER. Dagiti Panagrang-ay ti Siensia ISSN 2375-2548.